Вопросы вирусологии. 2022; 67: 341-350
Разработка способа выявления специфических антител к белку Е вируса жёлтой лихорадки (Flaviviridae: Flavivirus) методом иммуноферментного анализа
https://doi.org/10.36233/0507-4088-123Аннотация
Введение. Жёлтая лихорадка (ЖЛ) остаётся одной из самых распространённых природно-очаговых инфекционных болезней в мире. В связи с возрастающим туристическим потоком в страны, эндемичные по ЖЛ, обнаружением на территории южных регионов России устойчивых популяций комаров видов Aedes aegypti и Ae. albopictus, являющихся основными переносчиками вируса ЖЛ (ВЖЛ), и тем фактом, что в медицинских учреждениях нашей страны можно получить живую аттенуированную вакцину против ЖЛ, но нет возможности оценки эффективности вакцинации, возникает вопрос о разработке и внедрении в практику диагностических наборов для выявления антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Цель работы – разработка способа выявления специфических антител класса IgG к белку Е ВЖЛ методом ИФА и оценка его диагностических характеристик.
Материалы и методы. Методом обратной транскрипции на матрице РНК ВЖЛ, выделенного на клеточной культуре Aedes albopictus clone C6/36, синтезирована специфичная кДНК и амплифицирован участок генома белка Е ВЖЛ, который был клонирован в плазмиду pET160 (Thermo Fisher Scientific, США). Полученный фрагмент гена использовали в качестве ДНК-матрицы для создания рекомбинантного аналога третьего домена белка Е ВЖЛ в клетках Escherichia coli (BL-21(DE3)). Далее произведена оценка иммуногенности полученного антигена и оптимизация условий анализа.
Результаты. Определены оптимальные условия наработки полученного рекомбинантного белка Е ВЖЛ, подтверждена его специфичность иммунологическими методами (вестерн-блоттинг и ИФА), подобраны сорбционные буферы и блокирующие растворы, проведён анализ чувствительности и специфичности рекомбинантного антигена и антител к ВЖЛ.
Заключение. Был разработан способ выявления специфических антител класса IgG к белку Е ВЖЛ методом ИФА. Данный диагностический набор может использоваться как для изучения протективных свойств вакцины против ЖЛ, так и для выявления завозных случаев инфекции на неэндемичных территориях.
Список литературы
1. WHO. Health topic. Yellow fever. Available at: https://www.who.int/health-topics/yellow-fever
2. Львов Д.К., ред. Медицинская вирусология: руководство. М.: МИА; 2008.
3. Lindenbach B.D., Rice C.M. Molecular biology of flaviviruses. Adv. Virus Res. 2003; 59: 23–61. https://doi.org/10.1016/s0065-3527(03)59002-9
4. Douam F., Ploss A. Yellow fever virus: Knowledge gaps impeding the fight against an old foe. Trends Microbiol. 2018; 26(11): 913– 28. https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.05.012
5. Monath T.P. Yellow fever: an update. Lancet Infect. Dis. 2001; 1(1): 11–20. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(01)00016-0
6. Ганушкина Л.А., Дремова В.П. Комары Aedes aegypti L. и Aedes albopictus skuse – новая биологическая угроза для юга России. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2012; (3): 49–55.
7. Ганушкина Л.А., Таныгина Е.Ю., Безжонова О.В., Сергиев В.П. Об обнаружении комаров Aedes (Stegomyia) albopictuss на территории Российской Федерации. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2012; (1): 3–4.
8. Коваленко И.С., Якунин С.Н., Абибулаев Д.Э., Владычак В.В., Бородай Н.В., Смелянский В.П. и др. Обнаружение Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse, 1895) в Крыму. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; (2): 135–7. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-2-135-137
9. Ясюкевич В.В., Попов И.О., Титкина С.Н., Ясюкевич Н.В. Адвентивные виды Aedes на территории России − оценка риска новой биологической угрозы здоровью населения России. Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. 2017; 28(3): 51–71. https://doi.org/10.21513/0207-2564-2017-3-51-71
10. Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Удмуртской Республике. О профилактике желтой лихорадки; 2022. Available at: https://18.rospotrebnadzor.ru/content/354/110271/
11. Кривошеина Е.И., Карташов М.Ю., Найденова Е.В. Современные лабораторные методы выявления возбудителя желтой лихорадки. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; (2): 24–32. https://doi.org/10.21055/0370-1069-202-2-21-32
12. Heinz F.X., Stiasny K., Püschner-Auer G., Holzmann H., Allison S.L., Mandl C.W., et al. Structural changes and functional control of the tick-borne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM. Virology. 1994; 198(1): 109–17. https://doi.org/10.1006/viro.1994.1013
13. Chávez J.H., Silva J.R., Amarilla A.A., Moraes Figueiredo L.T. Domain III peptides from flavivirus envelope protein are useful antigens for serologic diagnosis and targets for immunization. Biologicals. 2010; 38(6): 613–8. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2010.07.004
14. Volk D.E., May F.J., Gandham S.H., Anderson A., Von Lindern J.J., Beasley D.W., et al. Structure of yellow fever virus envelope protein domain III. Virology. 2009; 394(1): 12–8. https://doi.org/10.1016/j.virol.2009.09.001
15. Радаева И.Ф., Нечаева Е.А., Дроздов И.Г. Коллекция культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Новосибирск: ЦЭРИС; 2009.
16. Marshall O.J. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 2004; 20(15): 2471–2. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bth254
17. National Center for Biotechnology Information. GenBank Overview. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
18. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M.; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8): 1166–7. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts091
19. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 2016; 33(7): 1870–4. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054
20. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680–5. https://doi.org/10.1038/227680a0
Problems of Virology. 2022; 67: 341-350
Development of a method for detection of specific antibodies to E protein of yellow fever virus (Flaviviridae: Flavivirus) by enzyme immunoassay
https://doi.org/10.36233/0507-4088-123Abstract
Introduction. Yellow fever (YF) remains one of the most common natural focal infectious diseases in the world. In connection with the increasing tourist flow to countries endemic for YF, the discovery of stable populations of Aedes aegypti and Ae. albopictus which are the main vectors of the yellow fever virus (YFV), in the southern regions of Russia, and the fact that in medical institutions in our country it is possible to obtain a live attenuated vaccine against YF, but there is no way to evaluate the effectiveness of vaccination, the question arises of the development and implementation of diagnostic kits for detecting antibodies (AB) to the pathogen by enzyme immunoassay (ELISA).
The aim of this study was to develop a method for detecting specific IgG antibodies to the E protein of YFV by ELISA and assessing its diagnostic characteristics.
Materials and methods. A specific cDNA was synthesized by reverse transcription on an RNA template of YFV isolated on a cell culture of Aedes albopictus clone C6/36, and a fragment of the genome coding the YFV E protein was amplified and subsequently cloned into the plasmid pET160 (Thermo Fisher Scientific, USA). The resulting gene fragment was used as a DNA template to obtain a recombinant analog of the third domain of the YFV E protein in Escherichia coli cells (BL-21(DE3)). Next, the immunogenicity of the obtained antigen was evaluated and the analysis conditions were optimized.
Results. The optimal conditions for the production of the obtained recombinant E protein of YFV were determined, its specificity was confirmed by immunological methods (Western blot and ELISA), sorption buffers and blocking solutions were selected, and sensitivity and specificity of detection of antibodies to YFV using the recombinant antigen were assessed.
Conclusion. A method for the detection of specific IgG antibodies to the YFV E protein by ELISA was developed. This diagnostic kit can be used both to study the protective properties of the YF vaccine and to detect imported cases of infection in non-endemic areas.
References
1. WHO. Health topic. Yellow fever. Available at: https://www.who.int/health-topics/yellow-fever
2. L'vov D.K., red. Meditsinskaya virusologiya: rukovodstvo. M.: MIA; 2008.
3. Lindenbach B.D., Rice C.M. Molecular biology of flaviviruses. Adv. Virus Res. 2003; 59: 23–61. https://doi.org/10.1016/s0065-3527(03)59002-9
4. Douam F., Ploss A. Yellow fever virus: Knowledge gaps impeding the fight against an old foe. Trends Microbiol. 2018; 26(11): 913– 28. https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.05.012
5. Monath T.P. Yellow fever: an update. Lancet Infect. Dis. 2001; 1(1): 11–20. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(01)00016-0
6. Ganushkina L.A., Dremova V.P. Komary Aedes aegypti L. i Aedes albopictus skuse – novaya biologicheskaya ugroza dlya yuga Rossii. Meditsinskaya parazitologiya i parazitarnye bolezni. 2012; (3): 49–55.
7. Ganushkina L.A., Tanygina E.Yu., Bezzhonova O.V., Sergiev V.P. Ob obnaruzhenii komarov Aedes (Stegomyia) albopictuss na territorii Rossiiskoi Federatsii. Meditsinskaya parazitologiya i parazitarnye bolezni. 2012; (1): 3–4.
8. Kovalenko I.S., Yakunin S.N., Abibulaev D.E., Vladychak V.V., Borodai N.V., Smelyanskii V.P. i dr. Obnaruzhenie Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse, 1895) v Krymu. Problemy osobo opasnykh infektsii. 2020; (2): 135–7. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-2-135-137
9. Yasyukevich V.V., Popov I.O., Titkina S.N., Yasyukevich N.V. Adventivnye vidy Aedes na territorii Rossii − otsenka riska novoi biologicheskoi ugrozy zdorov'yu naseleniya Rossii. Problemy ekologicheskogo monitoringa i modelirovaniya ekosistem. Problemy ekologicheskogo monitoringa i modelirovaniya ekosistem. 2017; 28(3): 51–71. https://doi.org/10.21513/0207-2564-2017-3-51-71
10. Upravlenie Federal'noi sluzhby po nadzoru v sfere zashchity prav potrebitelei i blagopoluchiya cheloveka po Udmurtskoi Respublike. O profilaktike zheltoi likhoradki; 2022. Available at: https://18.rospotrebnadzor.ru/content/354/110271/
11. Krivosheina E.I., Kartashov M.Yu., Naidenova E.V. Sovremennye laboratornye metody vyyavleniya vozbuditelya zheltoi likhoradki. Problemy osobo opasnykh infektsii. 2021; (2): 24–32. https://doi.org/10.21055/0370-1069-202-2-21-32
12. Heinz F.X., Stiasny K., Püschner-Auer G., Holzmann H., Allison S.L., Mandl C.W., et al. Structural changes and functional control of the tick-borne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM. Virology. 1994; 198(1): 109–17. https://doi.org/10.1006/viro.1994.1013
13. Chávez J.H., Silva J.R., Amarilla A.A., Moraes Figueiredo L.T. Domain III peptides from flavivirus envelope protein are useful antigens for serologic diagnosis and targets for immunization. Biologicals. 2010; 38(6): 613–8. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2010.07.004
14. Volk D.E., May F.J., Gandham S.H., Anderson A., Von Lindern J.J., Beasley D.W., et al. Structure of yellow fever virus envelope protein domain III. Virology. 2009; 394(1): 12–8. https://doi.org/10.1016/j.virol.2009.09.001
15. Radaeva I.F., Nechaeva E.A., Drozdov I.G. Kollektsiya kul'tur kletok FBUN GNTs VB «Vektor» Rospotrebnadzora. Novosibirsk: TsERIS; 2009.
16. Marshall O.J. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 2004; 20(15): 2471–2. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bth254
17. National Center for Biotechnology Information. GenBank Overview. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
18. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M.; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8): 1166–7. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts091
19. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 2016; 33(7): 1870–4. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054
20. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680–5. https://doi.org/10.1038/227680a0
