Вопросы вирусологии. 2020; 65: 132-142
Тест-система для выявления IgG-антител к вирусу гепатита Е (Hepeviridae, Orthohepevirus, Orthohepevirus A) методом линейного иммуноанализа
https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-3-132-142Аннотация
Введение. Эффективность методов серодиагностики гепатита Е варьирует в широких пределах, поэтому рекомендуется комбинированное использование тестов различных форматов.
Цель исследования – разработка тест-системы для выявления IgG-антител к вирусу гепатита Е (ВГЕ) в сыворотке крови человека методом линейного иммуноанализа (ЛИА).
Материал и методы. Образцы сывороток крови больных гепатитами и условно здоровых лиц типировали с применением коммерческих иммуноферментных тест-систем на IgG-антитела к возбудителям вирусных гепатитов и иных инфекций, вызывающих патологию печени. В ЛИА применяли рекомбинантные антигены ORF2 и ORF3 ВГЕ 1-го и 3-го генотипов. В качестве тест-системы сравнения использовали набор реагентов «RecomLine HEV IgG/IgM» (Mikrogen GmbH, Германия).
Результаты. Разработана первая отечественная тест-система «Блот-ВГЕ», предназначенная для выявления IgG-антител к индивидуальным белкам ВГЕ в сыворотке крови человека методом ЛИА. Антигенная основа представлена полосками нитроцеллюлозной мембраны с иммобилизованными на ней в виде дискретных линий рекомбинантными антигенами, содержащими С-концевые фрагменты белков ORF2 (406–660 а.о.), полноразмерные последовательности белков ORF3 (1–113 а.о.) ВГЕ 1-го и 3-го генотипов, и контрольными антигенами. Конъюгат – меченные пероксидазой хрена моноклональные антитела мыши к IgG человека, раствор хромогена содержит 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин. Предусмотрен визуальный и цифровой учёт результатов. Аналитическая чувствительность тест-системы составила 0,625 МЕ/мл для антигенов ORF2 и 2,5 МЕ/мл для антигенов ORF3. Показано, что эндогенные интерференты не влияют на результаты анализа и отсутствуют перекрёстные реакции с антителами к возбудителям гепатитов иной этиологии. Чувствительность тест-системы в сравнении с набором «RecomLine HEV IgG/IgM» составила 92%, специфичность – 97%. Определён срок её годности в заданных условиях хранения – 12 мес.
Заключение. Разработана тест-система для подтверждения результатов иммуноферментного анализа в лабораторной диагностике гепатита Е.
Список литературы
1. Favorov M.O., Fields H.A., Purdy M.A., Yashina T.L., Aleksandrov A.G., Alter M.J., et al. Serologic identification of hepatitis E virus infections in epidemic and endemic settings. J. Med. Virol. 1992; 36(4): 246-50. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.1890360403
2. Khudyakov Y.E., Kamili S. Serological diagnostics of hepatitis E virus infection. Virus Res. 2011; 161(1): 84-92. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2011.06.006
3. EASL Clinical Practice Guidelines on hepatitis E virus infection. J. Hepathol. 2018; 68(6): 1256-71. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jhep.2018.03.005
4. Kodani M., Kamili N.A., Tejada-Strop A., Poe A., Denniston M.M., Drobeniuc J., et al. Variability in the performance characteristics of IgG anti-HEV assays and its impact on reliability of seroprevalence rates of hepatitis E. J. Med. Virol. 2017; 89(6): 1055-61. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.24741
5. Hartl J., Otto B., Madden R.G., Webb G., Woolson K.L., Kriston L., et al. Hepatitis E seroprevalence in Europe: a meta-analysis. Viruses. 2016; 8(8): 211. DOI: http://doi.org/10.3390/v8080211
6. Mikrogen. recomLine HEV IgG/IgM. Available at: https://mikrogen.de/english/deutschland/products/product-overview/testsystem/hev-iggigm.html
7. Ma H., Song X., Li Z., Harrison T.J., Zhang H., Huang W., et al. Varying abilities of recombinant polypeptides from different regions of hepatitis E virus ORF2 and ORF3 to detect anti-HEV immunoglobulin M. J. Med. Virol. 2009; 81(6): 1052-61. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.21484
8. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Амиантова И.И., Доценко В.В. и др. Рекомбинантный белок, содержащий антигенно-значимые фрагменты белков вируса гепатита Е, используемый в тест-системах для серодиагностики гепатита Е (варианты). Патент РФ № 2711907C2; 2020.
9. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Доценко В.В., Амиантова И.И. и др. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 1-го генотипа с применением метода оптимизации кодонов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 94(6): 63-72. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-6-63-72
10. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Доценко В.В., Амиантова И.И. и др. Получение рекомбинантного аналога капсидного белка вируса гепатита Е первого генотипа: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 94(6): 72-80. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-6-72-80
11. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Милованова А.В., Аммур Ю.И. и др. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 3 генотипа и оценка его антигенных свойств. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 95(5): 46-53. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-5-46-53
12. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н., Лухверчик Л.Н., Доценко В.В., Амиантова И.И. и др. Разработка рекомбинантного белка капсида вируса гепатита е третьего генотипа: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; 96(1): 10-7. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-10-17
13. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Штамм бактерий Escherichia coli, используемый для получения рекомбинантных белков. Патент РФ № 2043409; 1992.
14. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Вектор pEL5a, предназначенный для экспрессии чужеродной ДНК. Патент РФ № 2071501; 1992.
15. Ulanova T.I., Obriadina A.P., Talekar G., Burkov A.N., Fields H.A., Khudyakov Y.E. A new artificial antigen of the hepatitis E virus. J. Immunoassay Immunochem. 2009; 30(1): 18-39. DOI: http://doi.org/10.1080/15321810802570269
16. Avellon A., Morago L., Garcia-Galera del Carmen M., Munoz M., Echevarría J.M. Comparative sensitivity of commercial tests for hepatitis E genotype 3 virus antibody detection. J. Med. Virol. 2015; 87(11): 1934-9. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.24251
17. Al-Sadeq Duaa W., Majdalawieh A.F., Mesleh A.G., Abdalla O.M., Nasrallah G.K. Laboratory challenges in the diagnosis of hepatitis E virus. J. Med. Microbiol. 2018; 67(4): 466-80. DOI: http://doi.org/10.1099/jmm.0.000706
Problems of Virology. 2020; 65: 132-142
Line immunoassay for detection of IgG antibodies to hepatitis E virus (Hepeviridae, Orthohepevirus, Orthohepevirus A)
https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-3-132-142Abstract
Introduction. The diagnostic efficacy of methods for hepatitis E serodiagnostic varies over a wide range; therefore, the combined use of tests of various formats is recommended. The aim of the research was to develop a test system for the detection of IgG antibodies to hepatitis E virus (HEV) in human serum by linear immunoassay (LIA).
Material and methods. Serum samples from patients with hepatitis and healthy individuals were tested using commercial enzyme-linked immunosorbent assay systems for the presence of IgG antibodies to viral agents causing hepatitis and other infections associated with liver pathology. Recombinant antigens ORF2 and ORF3 of HEV genotypes 1 and 3 were used. The “RecomLine HEV IgG/IgM” reagent kit (Mikrogen GmbH, Germany) was used as a comparison test system.
Results. The first Russian diagnostic kit “Blot-HEV”, designed to detect IgG antibodies to individual HEV proteins in human serum using LIA, was developed. The antigenic base is represented by strips of a nitrocellulose membrane with immobilized recombinant antigens ORF2 (aa 406–660) and ORF3 (aa 1–113) of HEV genotypes 1 and 3, and control antigens in the form of discrete lines. The conjugate was mouse monoclonal antibodies to human class G immunoglobulins labeled with horseradish peroxidase. The chromogen solution contained the 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine. A visual and digital recording of results was provided. The analytical sensitivity of the test kit was 0.625 IU/ml for ORF2 antigens and 2.5 IU/ml for ORF3 antigens. The absence of the influence of endogenous interfering substances on the results of the analysis and the absence of cross-reactions with antibodies to hepatitis pathogens of the other etiologies had been shown. The sensitivity of the test system compared to the “RecomLine HEV IgG/IgM” kit was 92%, specificity 97%. Shelf life in condition of storage was determined to be 12 months.
Conclusions. The developed test can be used to confirm the results of ELISA in laboratory diagnosis of hepatitis E.
References
1. Favorov M.O., Fields H.A., Purdy M.A., Yashina T.L., Aleksandrov A.G., Alter M.J., et al. Serologic identification of hepatitis E virus infections in epidemic and endemic settings. J. Med. Virol. 1992; 36(4): 246-50. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.1890360403
2. Khudyakov Y.E., Kamili S. Serological diagnostics of hepatitis E virus infection. Virus Res. 2011; 161(1): 84-92. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2011.06.006
3. EASL Clinical Practice Guidelines on hepatitis E virus infection. J. Hepathol. 2018; 68(6): 1256-71. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jhep.2018.03.005
4. Kodani M., Kamili N.A., Tejada-Strop A., Poe A., Denniston M.M., Drobeniuc J., et al. Variability in the performance characteristics of IgG anti-HEV assays and its impact on reliability of seroprevalence rates of hepatitis E. J. Med. Virol. 2017; 89(6): 1055-61. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.24741
5. Hartl J., Otto B., Madden R.G., Webb G., Woolson K.L., Kriston L., et al. Hepatitis E seroprevalence in Europe: a meta-analysis. Viruses. 2016; 8(8): 211. DOI: http://doi.org/10.3390/v8080211
6. Mikrogen. recomLine HEV IgG/IgM. Available at: https://mikrogen.de/english/deutschland/products/product-overview/testsystem/hev-iggigm.html
7. Ma H., Song X., Li Z., Harrison T.J., Zhang H., Huang W., et al. Varying abilities of recombinant polypeptides from different regions of hepatitis E virus ORF2 and ORF3 to detect anti-HEV immunoglobulin M. J. Med. Virol. 2009; 81(6): 1052-61. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.21484
8. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N., Lukhverchik L.N., Amiantova I.I., Dotsenko V.V. i dr. Rekombinantnyi belok, soderzhashchii antigenno-znachimye fragmenty belkov virusa gepatita E, ispol'zuemyi v test-sistemakh dlya serodiagnostiki gepatita E (varianty). Patent RF № 2711907C2; 2020.
9. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N., Lukhverchik L.N., Dotsenko V.V., Amiantova I.I. i dr. Poluchenie rekombinantnogo belka ORF3 virusa gepatita E 1-go genotipa s primeneniem metoda optimizatsii kodonov. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2017; 94(6): 63-72. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-6-63-72
10. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N., Lukhverchik L.N., Dotsenko V.V., Amiantova I.I. i dr. Poluchenie rekombinantnogo analoga kapsidnogo belka virusa gepatita E pervogo genotipa: klonirovanie, ekspressiya, ochistka, otsenka antigennykh svoistv. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2017; 94(6): 72-80. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-6-72-80
11. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N., Lukhverchik L.N., Milovanova A.V., Ammur Yu.I. i dr. Poluchenie rekombinantnogo belka ORF3 virusa gepatita E 3 genotipa i otsenka ego antigennykh svoistv. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2018; 95(5): 46-53. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-5-46-53
12. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N., Lukhverchik L.N., Dotsenko V.V., Amiantova I.I. i dr. Razrabotka rekombinantnogo belka kapsida virusa gepatita e tret'ego genotipa: klonirovanie, ekspressiya, ochistka, otsenka antigennykh svoistv. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2019; 96(1): 10-7. DOI: http://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-10-17
13. Alatortsev V.E., Alatortseva G.I. Shtamm bakterii Escherichia coli, ispol'zuemyi dlya polucheniya rekombinantnykh belkov. Patent RF № 2043409; 1992.
14. Alatortsev V.E., Alatortseva G.I. Vektor pEL5a, prednaznachennyi dlya ekspressii chuzherodnoi DNK. Patent RF № 2071501; 1992.
15. Ulanova T.I., Obriadina A.P., Talekar G., Burkov A.N., Fields H.A., Khudyakov Y.E. A new artificial antigen of the hepatitis E virus. J. Immunoassay Immunochem. 2009; 30(1): 18-39. DOI: http://doi.org/10.1080/15321810802570269
16. Avellon A., Morago L., Garcia-Galera del Carmen M., Munoz M., Echevarría J.M. Comparative sensitivity of commercial tests for hepatitis E genotype 3 virus antibody detection. J. Med. Virol. 2015; 87(11): 1934-9. DOI: http://doi.org/10.1002/jmv.24251
17. Al-Sadeq Duaa W., Majdalawieh A.F., Mesleh A.G., Abdalla O.M., Nasrallah G.K. Laboratory challenges in the diagnosis of hepatitis E virus. J. Med. Microbiol. 2018; 67(4): 466-80. DOI: http://doi.org/10.1099/jmm.0.000706
