Вопросы вирусологии. 2020; 65: 95-102
Выявление пестивирусов крупного рогатого скота при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-95-102Аннотация
Введение. Пестивирусы - причина репродуктивных проблем, болезней желудочно-кишечного и респираторного тракта животных. Для крупного рогатого скота значение имеют три вида: Pestivirus A, B и H. В настоящее время необходимы быстрые и надёжные методы дискриминации данных патогенов.
Цели и задачи исследования: разработка мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для одновременного выявления и дифференциации трёх вирусов в режиме реального времени (РТ-ПЦР).
Материал и методы. Мишенью для амплификации служили нуклеотидные последовательности консервативных участков генов 5´-UTR пестивирусов A, B и H.
Результаты. Реакция показала высокую специфичность, чувствительность, воспроизводимость и выявляла РНК вирусов в концентрации не менее 0,6-1,2 lg ТЦД50/см3. Перекрёстных реакций с другими пестивирусами не наблюдали. РТ-ПЦР подтвердила результаты, полученные ранее в ОТ-ПЦР в режиме гель-электрофореза. При параллельном исследовании 1823 проб биоматериала результаты двух реакций полностью совпали. Pestivirus spр. выявлены в 76 пробах: Pestivirus A присутствовал в 73 пробах, B - в трёх, а H не обнаружен.
Обсуждение. Разработана двухшаговая РТ-ПЦР для одновременного выявления и типирования трёх пестивирусов. Для первой реакции использовали модифицированные панпраймеры S. Vilcek и соавт., а для типирования - праймеры и зонды собственного дизайна, что обеспечило высокую эффективность реакции.
Заключение. На молочных комплексах по содержанию скота создаются условия для циркуляции патогенных вирусов. В такой ситуации необходимы методы экспресс-диагностики, позволяющие в короткие сроки выявить несколько вирусов. Триплексный анализ в режиме реального времени может быть рекомендован в качестве экспресс-метода при массовых эпизоотологических исследованиях, а также для скрининга эмбрио-нальной сыворотки, используемой для культивирования вирусов в медицине и ветеринарии.
Список литературы
1. Evans C.A., Pinior B., Larska M., Graham D., Schweizer M., Guidarini C., et al. Global knowledge gaps in the prevention and control of bovine viral diarrhoea (BVD) virus. Transbound. Emerg. Dis. 2019; 66(2): 640-52. DOI: https://doi.org/10.1111/tbed.13068
2. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Шуляк А.Ф. Пестивирусы жвачных животных. Вопросы вирусологии. 2016; 61(2): 59-2. DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-2-59-62
3. Гулюкин М.И., Юров К.П., Глотов А.Г., Донченко Н.А. Стратегия борьбы с вирусной диареей – болезнью слизистых крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах российской федерации. Вопросы вирусологии. 2013; 58(6): 13-8.
4. Ridpath J.F. Bovine viral diarrhea virus: global status. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 2010; 26(1): 105-21. DOI: http://doi.org/10.1016/j.cvfa.2009.10.007
5. Bauermann F.V., Ridpath J.F., Weiblen R., Flores E.F. HoBi-like viruses: an emerging group of pestiviruses. J. Vet. Diagn. Invest. 2013; 25(1): 6-15. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638712473103
6. Simmonds P., Becher P., Bukh J., Gould E.A., Meyers G., Monath T., et al. ICTV virus taxonomy profile: Flaviviridae. J. Gen. Virol. 2017; 98(1): 2-3. DOI: http://doi.org/10.1099/jgv.0.000672
7. Pinior B., Firth C.L., Richter V., Lebl K., Trauffler M., Dzieciol M., et al. A systematic review of financial and economic assessments of bovine viral diarrhea virus (BVDV) prevention and mitigation activities worldwide. Prev. Vet. Med. 2017; 137(Pt. A): 77-92. DOI: http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2016.12.014
8. Верховская А.Е., Сергеев В.А., Алипер Т.И., Иванов Е.В. Особенности диагностики и профилактики вирусной диареи крупного рогатого скота. Ветеринария. 2009; (8): 3-7.
9. Глотов А.Г., Глотова Т.И., Петрова О.Г., Нефедченко А.В., Татарчук А.Т., Котенева С.В. и др. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота. Ветеринария. 2002; (3): 17-1.
10. Шилова Е.Н., Ряпосова М.В., Шкуратова И.А., Вялых Е.В. Вирусная диарея – болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота в Уральском регионе. Ветеринария. 2014; (5): 19-21.
11. Черных О.Ю., Шевченко А.А., Джаилиди Г.А., Мищенко В.А., Мищенко А.В., Шевкопляс В.Н. Проблемы вирусной диареи крупного рогатого скота. Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2016; (58): 194-8.
12. Глотов А.Г., Глотова Т.И. Атипичные пестивирусы крупного рогатого скота. Сельскохозяйственная биология. 2015; 50(4): 399-408. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.4.399rus
13. Evermann J.F., Ridpath J.F. Clinical and epidemiologic observations of bovine viral diarrhea virus in the northwestern United States. Vet. Microbiol. 2002; 89(2-3): 129-39. DOI: http://doi.org/10.1016/s0378-1135(02)00178-5
14. Bauermann F.V., Ridpath J.F., Weiblen R., Flores E.F. HoBi-like viruses: an emerging group of pestiviruses. J. Vet. Diagn. Invest. 2013; 25(1): 6-15. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638712473103
15. Урываев Л.В., Ионова К.С., Дедова А.В., Дедова Л.В., Селиванова Т.К., Парасюк Н.А. и др. Анализ контаминации клеточных культур пестивирусом BVDV и микоплазмами. Вопросы вирусологии. 2012; 57(5): 15-21.
16. Giangaspero M. Pestivirus species potential adventitious contaminants of biological products. Trop. Med. Surg. 2013; 1(6). DOI: http://doi.org/10.4172/2329-9088.1000153
17. Simmonds P., Becher P., Collett M.S., Gould E.A., Heinz F.X., Meyers G. Family Flaviviridae. In: King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., eds. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Science; 2011: 1003-20.
18. Bauermann F.V., Flores E.F., Ridpath J.F. Antigenic relationships between Bovine viral diarrhea virus 1 and 2 and HoBi virus: possible impacts on diagnosis and control. J. Vet. Diagn. Invest. 2012; 24(2): 253-61. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638711435144
19. Liu L., Xia H., Wahlberg N., Belák S., Baule C. Phylogeny, classification and evolutionary insights into pestiviruses. Virology. 2009; 385(2): 351-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virol.2008.12.004
20. Yesilbag K., Alpay G., Becher P. Variability and global distribution of subgenotypes of bovine viral diarrhea virus. Viruses. 2017; 9(6): E128. DOI: http://doi.org/10.3390/v9060128
21. Vilcek S., Herring A.J., Herring J.A., Nettleton P.F., Lowings J.P., Paton D.J. Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis. Arch. Virol. 1994; 136(3-4): 309-23. DOI: http://doi.org/10.1007/bf01321060
22. Nagai M., Hayashi M., Sugita S., Sakoda Y., Mori M., Murakami T., et al. Phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea viruses using five different genetic regions. Virus. Res. 2004; 99(2): 103-13. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2003.10.006
23. Gilbert S.A., Burton K.M., Prins S.E., Deregt D. Typing of bovine viral diarrhea viruses directly from blood of persistently infected cattle by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 1999; 37(6): 2020-3.
24. Letellier C., Kerkhofs P. Real-time PCR for simultaneous detection and genotyping of bovine viral diarrhea virus. J. Virol. Methods. 2003; 114(1): 21-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2003.08.004
25. Baxi M., McRae D., Baxi S., Greiser-Wilke I., Vilcek S., Amoako K., et al. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses. Vet. Microbiol. 2006; 116(1-3): 37-44. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2006.03.026
26. La Rocca S.A., Sandvik T. A short target real-time RT-PCR assay for detection of pestiviruses infecting cattle. J. Virol. Methods. 2009; 161(1): 122-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2009.06.005
27. Decaro N., Sciarretta R., Lucente M.S., Mari V., Amorisco F., Colaianni M.L., et al. A nested PCR approach for unambiguous typing of Pestiviruses infecting cattle. Mol. Cell. Probes. 2012; 26(1): 42-6. DOI: http://doi.org/10.1016/j.mcp.2011.11.003
28. Mari V., Losurdo M., Lucente M.S., Lorusso E., Elia G., Martella V., et al. Multiplex real-time RT-PCR assay for bovine viral diarrhea virus type 1, type 2 and HoBi-like pestivirus. J. Virol. Methods. 2016; 229: 1-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2015.12.003
29. Monteiro F.L., Cargnelutti J.F., Martins B., Noll J.G., Weiblen R., Flores E.F. Detection of bovine pestiviruses in sera of beef calves by a RT-PCR based on a newly designed set of pan-bovine pestivirus primers. J. Vet. Diagn. Invest. 2019; 31(2): 255-8. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638719826299
30. Глотов А.Г., Котенева С.В., Глотова Т.И., Южаков А.Г., Максютов Р.А., Забережный А.Д. Филогенетический анализ пестивирусов крупного рогатого скота, выявленных в Сибири. Вопросы вирусологии. 2018; 63(4): 185-91. DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-4-185-191
31. Котенева С.В., Максютов Р.А., Глотова Т.И., Глотов А.Г. Идентификация атипичного пестивируса крупного рогатого скота в биологических образцах. Сельскохозяйственная биология. 2017; 52(6): 1259-64. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2017.6.1259rus
32. Котенева С.В., Нефедченко А.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г. Генетический полиморфизм возбудителя вирусной диареи (болезни слизистых оболочек) крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири. Сельскохозяйственная биология. 2018; 53(6): 1238-46. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2018.6.1238rus
Problems of Virology. 2020; 65: 95-102
Detection of bovine pestiviruses by a multiplex real-time polymerase chain reaction
https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-2-95-102Abstract
Introduction. Pestiviruses are the cause of reproductive problems, diseases of the gastrointestinal and respiratory tracts of animals. Three species are important for cattle: Pestivirus A, B, and H. Fast and reliable methods of differentiation of these pathogens are currently needed.
Aims and objectives of the study: the development of multiplex real time PCR for the simultaneous detection and differentiation of three viruses.
Material and methods. The nucleotide sequences of the conserved regions of the 5´-UTR genes of pestiviruses A, B, and H served as a target.
Results. The reaction showed high specificity, sensitivity, reproducibility and was able to detect virus RNA at a concentration of not less than 0.6-1.2 lg TCID50/cm3. Cross-reactions with other pestiviruses were not observed. Real time PCR confirmed the results obtained previously in RT-PCR with gel electrophoresis detection. In a parallel study of 1823 biological samples, the results of the two reactions were completely consistent. Pestivirus spp. was detected in 76 samples, Pestivirus A was present in 73 samples, Pestivirus B - in 3 samples, and Pestivirus H was not detected.
Discussion. A two-step real time PCR was developed for the simultaneous detection and differentiation of three pestiviruses. Modified pan primers of S. Vilcek et al. were used for the first reaction, and primers and probes of our own design were used for virus typing, which resulted in high reaction efficiency.
Conclusion. On the big dairy farms for livestock maintenance, there are favorable conditions for the circulation of pathogenic viruses. In this situation, rapid diagnostic methods are needed to quickly identify of several viruses. Real-time triplex analysis can be recommended as the rapid method for mass epidemiological studies, as well as for screening fetal calf serum used for virus cultivation in medicine and veterinary practice.
References
1. Evans C.A., Pinior B., Larska M., Graham D., Schweizer M., Guidarini C., et al. Global knowledge gaps in the prevention and control of bovine viral diarrhoea (BVD) virus. Transbound. Emerg. Dis. 2019; 66(2): 640-52. DOI: https://doi.org/10.1111/tbed.13068
2. Glotov A.G., Glotova T.I., Shulyak A.F. Pestivirusy zhvachnykh zhivotnykh. Voprosy virusologii. 2016; 61(2): 59-2. DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-2-59-62
3. Gulyukin M.I., Yurov K.P., Glotov A.G., Donchenko N.A. Strategiya bor'by s virusnoi diareei – bolezn'yu slizistykh krupnogo rogatogo skota v zhivotnovodcheskikh khozyaistvakh rossiiskoi federatsii. Voprosy virusologii. 2013; 58(6): 13-8.
4. Ridpath J.F. Bovine viral diarrhea virus: global status. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 2010; 26(1): 105-21. DOI: http://doi.org/10.1016/j.cvfa.2009.10.007
5. Bauermann F.V., Ridpath J.F., Weiblen R., Flores E.F. HoBi-like viruses: an emerging group of pestiviruses. J. Vet. Diagn. Invest. 2013; 25(1): 6-15. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638712473103
6. Simmonds P., Becher P., Bukh J., Gould E.A., Meyers G., Monath T., et al. ICTV virus taxonomy profile: Flaviviridae. J. Gen. Virol. 2017; 98(1): 2-3. DOI: http://doi.org/10.1099/jgv.0.000672
7. Pinior B., Firth C.L., Richter V., Lebl K., Trauffler M., Dzieciol M., et al. A systematic review of financial and economic assessments of bovine viral diarrhea virus (BVDV) prevention and mitigation activities worldwide. Prev. Vet. Med. 2017; 137(Pt. A): 77-92. DOI: http://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2016.12.014
8. Verkhovskaya A.E., Sergeev V.A., Aliper T.I., Ivanov E.V. Osobennosti diagnostiki i profilaktiki virusnoi diarei krupnogo rogatogo skota. Veterinariya. 2009; (8): 3-7.
9. Glotov A.G., Glotova T.I., Petrova O.G., Nefedchenko A.V., Tatarchuk A.T., Koteneva S.V. i dr. Rasprostranenie virusnykh respiratornykh boleznei krupnogo rogatogo skota. Veterinariya. 2002; (3): 17-1.
10. Shilova E.N., Ryaposova M.V., Shkuratova I.A., Vyalykh E.V. Virusnaya diareya – bolezn' slizistykh obolochek krupnogo rogatogo skota v Ural'skom regione. Veterinariya. 2014; (5): 19-21.
11. Chernykh O.Yu., Shevchenko A.A., Dzhailidi G.A., Mishchenko V.A., Mishchenko A.V., Shevkoplyas V.N. Problemy virusnoi diarei krupnogo rogatogo skota. Trudy Kubanskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. 2016; (58): 194-8.
12. Glotov A.G., Glotova T.I. Atipichnye pestivirusy krupnogo rogatogo skota. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2015; 50(4): 399-408. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2015.4.399rus
13. Evermann J.F., Ridpath J.F. Clinical and epidemiologic observations of bovine viral diarrhea virus in the northwestern United States. Vet. Microbiol. 2002; 89(2-3): 129-39. DOI: http://doi.org/10.1016/s0378-1135(02)00178-5
14. Bauermann F.V., Ridpath J.F., Weiblen R., Flores E.F. HoBi-like viruses: an emerging group of pestiviruses. J. Vet. Diagn. Invest. 2013; 25(1): 6-15. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638712473103
15. Uryvaev L.V., Ionova K.S., Dedova A.V., Dedova L.V., Selivanova T.K., Parasyuk N.A. i dr. Analiz kontaminatsii kletochnykh kul'tur pestivirusom BVDV i mikoplazmami. Voprosy virusologii. 2012; 57(5): 15-21.
16. Giangaspero M. Pestivirus species potential adventitious contaminants of biological products. Trop. Med. Surg. 2013; 1(6). DOI: http://doi.org/10.4172/2329-9088.1000153
17. Simmonds P., Becher P., Collett M.S., Gould E.A., Heinz F.X., Meyers G. Family Flaviviridae. In: King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., eds. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Science; 2011: 1003-20.
18. Bauermann F.V., Flores E.F., Ridpath J.F. Antigenic relationships between Bovine viral diarrhea virus 1 and 2 and HoBi virus: possible impacts on diagnosis and control. J. Vet. Diagn. Invest. 2012; 24(2): 253-61. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638711435144
19. Liu L., Xia H., Wahlberg N., Belák S., Baule C. Phylogeny, classification and evolutionary insights into pestiviruses. Virology. 2009; 385(2): 351-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virol.2008.12.004
20. Yesilbag K., Alpay G., Becher P. Variability and global distribution of subgenotypes of bovine viral diarrhea virus. Viruses. 2017; 9(6): E128. DOI: http://doi.org/10.3390/v9060128
21. Vilcek S., Herring A.J., Herring J.A., Nettleton P.F., Lowings J.P., Paton D.J. Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis. Arch. Virol. 1994; 136(3-4): 309-23. DOI: http://doi.org/10.1007/bf01321060
22. Nagai M., Hayashi M., Sugita S., Sakoda Y., Mori M., Murakami T., et al. Phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea viruses using five different genetic regions. Virus. Res. 2004; 99(2): 103-13. DOI: http://doi.org/10.1016/j.virusres.2003.10.006
23. Gilbert S.A., Burton K.M., Prins S.E., Deregt D. Typing of bovine viral diarrhea viruses directly from blood of persistently infected cattle by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 1999; 37(6): 2020-3.
24. Letellier C., Kerkhofs P. Real-time PCR for simultaneous detection and genotyping of bovine viral diarrhea virus. J. Virol. Methods. 2003; 114(1): 21-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2003.08.004
25. Baxi M., McRae D., Baxi S., Greiser-Wilke I., Vilcek S., Amoako K., et al. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses. Vet. Microbiol. 2006; 116(1-3): 37-44. DOI: http://doi.org/10.1016/j.vetmic.2006.03.026
26. La Rocca S.A., Sandvik T. A short target real-time RT-PCR assay for detection of pestiviruses infecting cattle. J. Virol. Methods. 2009; 161(1): 122-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2009.06.005
27. Decaro N., Sciarretta R., Lucente M.S., Mari V., Amorisco F., Colaianni M.L., et al. A nested PCR approach for unambiguous typing of Pestiviruses infecting cattle. Mol. Cell. Probes. 2012; 26(1): 42-6. DOI: http://doi.org/10.1016/j.mcp.2011.11.003
28. Mari V., Losurdo M., Lucente M.S., Lorusso E., Elia G., Martella V., et al. Multiplex real-time RT-PCR assay for bovine viral diarrhea virus type 1, type 2 and HoBi-like pestivirus. J. Virol. Methods. 2016; 229: 1-7. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jviromet.2015.12.003
29. Monteiro F.L., Cargnelutti J.F., Martins B., Noll J.G., Weiblen R., Flores E.F. Detection of bovine pestiviruses in sera of beef calves by a RT-PCR based on a newly designed set of pan-bovine pestivirus primers. J. Vet. Diagn. Invest. 2019; 31(2): 255-8. DOI: http://doi.org/10.1177/1040638719826299
30. Glotov A.G., Koteneva S.V., Glotova T.I., Yuzhakov A.G., Maksyutov R.A., Zaberezhnyi A.D. Filogeneticheskii analiz pestivirusov krupnogo rogatogo skota, vyyavlennykh v Sibiri. Voprosy virusologii. 2018; 63(4): 185-91. DOI: http://doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-4-185-191
31. Koteneva S.V., Maksyutov R.A., Glotova T.I., Glotov A.G. Identifikatsiya atipichnogo pestivirusa krupnogo rogatogo skota v biologicheskikh obraztsakh. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2017; 52(6): 1259-64. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2017.6.1259rus
32. Koteneva S.V., Nefedchenko A.V., Glotova T.I., Glotov A.G. Geneticheskii polimorfizm vozbuditelya virusnoi diarei (bolezni slizistykh obolochek) krupnogo rogatogo skota na molochnykh kompleksakh Sibiri. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2018; 53(6): 1238-46. DOI: http://doi.org/10.15389/agrobiology.2018.6.1238rus
