Разработка нового метода получения белка-антигена NS5A вируса гепатита C

Статья в Elpub

Вопросы вирусологии. 2017; 62: 17-25

Разработка нового метода получения белка-антигена NS5A вируса гепатита C

Кузнецова Т. В., Смирнова М. С., Леонович О. А., Гордейчук И. В., Бирюкова Ю. К., Зылькова М. В., Тыньо Я. Я., Белякова А. В., Шевелев А. Б.

https://doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-1-17-25

Аннотация

Задача создания универсальной платформы для получения доступных рекомбинантных продуцентов вирусных белков, обладающих иммуногенными свойствами, до настоящего времени не решена и по-прежнему актуальна. Высокая токсичность вирусных белков для клеток-хозяев, низкий уровень продукции, аномальный фолдинг целевых продуктов часто создают непреодолимые препятствия для конструирования продуцентов вирусных белков. В данной работе разработан новый метод конструирования и скрининга банков делеционных производных генов вирусных антигенов, обеспечивающий возможность создания их искусственных производных, адаптированных для экспрессии в клетках микробных продуцентов. В основе лежит метод ПЦР-амплификации фрагментов целевого гена с использованием системы вырожденных и адаптерных праймеров, позволяющий предотвратить самопроизвольное образование дуплексов (димеров) в отсутствие матричной ДНК. Для отбора делеционных производных, пригодных для экспрессии in vivo, полученные in vitro фрагменты клонированы в вектор прямой селекции pQL30, содержащий ген в-галактозидазы E. coli со встроенным полилинкером с мутацией смещения трансляционной рамки считывания. С использованием скринингового подхода на основе этого метода сконструирован искусственный вариант гена белка NS5A вируса гепатита С (ВГС), обладающий оптимальными биотехнологическими характеристиками. В работе использованы 27 образцов NS5A ВГС длиной 1670 п. н. Получен банк фрагментов исходного гена в форме смеси продуктов ПЦР. Отобрано 40 клонов с размером вставки от 50 до 700 п. н. путем клонирования фрагментов в вектор прямой селекции pQL30. Клоны протестированы на уровень β-галактозидазной активности и иммуногенные свойства. В результате отобран клон, продуцирующий растворимый белок массой около 114 кДа, накапливающийся с выходом до 0,3% от общего содержания белка в клетке и показавший положительную реакцию с антителами сыворотки крови больных, инфицированных ВГС генотипа 1b, но не с сыворотками здоровых доноров.

Список литературы

1. Benkovic S.J., Putney S.D., Schimmel P.R. Method for Degrading DNA. Patent USA № 4521509; 1985.

2. Sugino Y., Morita M., Matuo Y., Uchida K. Method for Producing DNA Nested Deletions by an in Vitro Reaction Using Transposase. Patent USA № 6265159; 2001.

3. Whitcomb J.M., Rashtchian A., Hughes S.H. A new PCR based method for the generation of nested deletions. Nucleic Acids Res. 1993; 21(17): 4143-6.

4. Bouzgarrou N., Hassen E., Mahfoudh W., Gabbouj S., Schvoerer E., Ben Yahia A. et al. NS5A(ISDR-V3) region genetic variability of Tunisian HCV-1b strains: Correlation with the response to the combined interferon/ribavirin therapy. J. Med. Virol. 2009; 81(12): 2021-8.

5. MacDonald A., Harris M. Hepatitis C virus NS5A: tales of a promiscuous protein. J. Gen. Virol. 2004; 85(9): 2485-502.

6. Muñoz de Rueda P., Casado J., Patón R., Quintero D., Palacios A., Gila A. et al. Mutations in E2-PePHD, NS5A-PKRBD, NS5A-ISDR, and NS5A-V3 of hepatitis C virus genotype 1 and their relationships to pegylated interferon-ribavirin treatment responses. J. Virol. 2008; 82(13): 6644-53.

7. Noguchi T., Tamori A., Ogura N., Hori Y., Ikeda S., Nishiguchi S. Investigation of interferon-α response by a single amino acid substitution of nonstructural protein 5A in hepatitis C virus-infected patients. J. Interferon Cytokine Res. 2011; 31(8): 589-99.

8. Sillanpää M., Melén K., Porkka P., Fagerlund R., Nevalainen K., Lappalainen M. et al. Hepatitis C virus core, NS3, NS4B and NS5A are the major immunogenic proteins in humoral immunity in chronic HCV infection. J.Virol. 2009; 6: 84.

9. Desombere I., Van Vlierberghe H., Weiland O., Hultgren C., Sällberg M., Quiroga J. et al. Serum levels of anti-NS4a and anti-NS5a predict treatment response of patients with chronic hepatitis C. J. Med Virol. 2007; 79(6): 701-13.

10. Swadling L., Capone S., Antrobus R.D., Brown A., Richardson R., Newell E.W. et al. A human vaccine strategy based on chimpanzee adenoviral and MVA vectors that primes, boosts, and sustains functional HCV-specific T cell memory. Sci. Transl. Med. 2014; 6(261): 261ra153.

Problems of Virology. 2017; 62: 17-25

A new method of producing NS5A antigen of hepatitis C virus

Kuznetsova T. V., Smirnova M. S., Leonovich O. A., Gordeichuk I. V., Biriukova I. K., Zylkova M. V., Tyn’O Ya. Ya., Belyakova A. V., Shevelev A. B.

https://doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-1-17-25

Abstract

A task of creating a universal platform for engineering affordable recombinant producers of viral proteins conserving immunogenicity has not been solved yet. High toxicity of the viral proteins for the host cells, low yield and abnormal folding of the products often present severe obstacles to obtaining producers of the viral proteins. In this work, we report a new method of engineering and screening of deletion libraries from the viral antigen genes. This method allows selection of artificial derivatives of these genes adapted for expression in microbial producer cells. The method involves PCR amplification of the gene fragments using a system of randomized and adapter primers, which allows the spontaneous formation of duplexes from the random primers in the absence of the template DNA to be prevented. For selecting variants capable of in vivo expression, the obtained PCR products are cloned to a special vector of a direct phenotypical selection pQL30. It contains E. coli β-galactosidase gene with an inserted polylinker producing a frame-shift mutation. Using this screening method, an artificial variant of hepatitis C (HCV) NS5a gene with optimal biotechnological properties was established. 27 clinical specimens of 1670 bp long HCV1b NS5a fragments were used as a source gene. A PCR bank of the deletion derivatives was produced. 40 LacZ-positive clones based on pQL30 vector with a 50-700 bp long insertion were selected. The LacZ activity of the cell lysates and the immunogenicity of the products were tested. As a result, a single clone encoding a soluble protein with Mr = 114 kDa was selected. Its yield reached 0.3% of the total cell protein. It was highly reactive with sera of HCV 1b infected patients but not with sera of the healthy donors.

References

1. Benkovic S.J., Putney S.D., Schimmel P.R. Method for Degrading DNA. Patent USA № 4521509; 1985.

2. Sugino Y., Morita M., Matuo Y., Uchida K. Method for Producing DNA Nested Deletions by an in Vitro Reaction Using Transposase. Patent USA № 6265159; 2001.

3. Whitcomb J.M., Rashtchian A., Hughes S.H. A new PCR based method for the generation of nested deletions. Nucleic Acids Res. 1993; 21(17): 4143-6.

5. MacDonald A., Harris M. Hepatitis C virus NS5A: tales of a promiscuous protein. J. Gen. Virol. 2004; 85(9): 2485-502.