Альманах клинической медицины. 2018; 46: 778-783
Применение метода интерференционной микроскопии для изучения структурных характеристик дермальных фибробластов в культуре
https://doi.org/10.18786/2072-0505-2018-46-8-778-783Аннотация
Актуальность. Применение методов электронной, атомно-силовой и конфокальной микроскопии для скрининга биологически активных соединений, изделий медицинского назначения и экспресс-диагностики ряда заболеваний на клеточном уровне связано с трудоемкой и длительной пробоподготовкой, которая не исключает возможность погрешностей измерений и возникновения артефактов. Этих недостатков лишен метод модуляционной интерференционной микроскопии, позволяющий осуществлять неинвазивные исследования клеточной структуры, получать изображение с нанометровым разрешением и проводить анализ оптических свойств объекта.
Цель – оценить возможность использования метода интерференционной микроскопии при изучении морфофункциональных характеристик ядер клеток в культуре на примере дермальных фибробластов при воздействии митомицином in vitro.
Материал и методы. Нативную культуру дермальных фибробластов человека 6-го пассажа, выращенную на стекле с зеркальным напылением в лаборатории культуры клеток Института экспериментальной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, исследовали при помощи модуляционного интерференционного микроскопа МИМ-340 (АО «ПО «УОМЗ», Россия). Оценивали динамику структурных характеристик ядер дермальных фибробластов при воздействии митомицином в условиях in vitro. Контрольную группу составила культура фибробластов, культивированная в аналогичных условиях на стеклах с зеркальным покрытием без добавления митомицина. Исследования на МИМ-340 проводили через 3 часа, 1 сутки и 4 суток после воздействия цитостатиком. Контрольную группу исследовали в те же сроки.
Результаты. Показано, что культура клеток, выращенная на диэлектрических стеклах, по морфофункциональным характеристикам не отличается от культуры, выращенной на культуральном пластике. Тем самым доказана возможность изучения адгезивной культуры в нативном состоянии с использованием интерференционной микроскопии. Установлено, что на однократное воздействие митомицином 0,04% клетки отвечают изменением формы на шаровидную и резким увеличением фазовой толщины ядер (217,8 против 142,18 нм в контрольной группе, p ≤ 0,05). В последующие сроки происходит восстановление морфофункциональных характеристик клеток, что подтверждается динамикой изменений плотности культуры, формы и размеров клеток, а также фазовой толщины ядра.
Заключение. Полученные результаты позволяют рекомендовать метод модуляционной интерференционной микроскопии для изучения токсичности и биосовместимости лекарственных средств, а также изделий медицинского назначения и физических факторов, используемых для диагностики и лечения.
Список литературы
1. Нефедова ИФ, Россинская ВВ, Волова ЛТ, Болтовская ВВ, Кулагина ЛН. Использование возможностей интерференционной микроскопии для изучения культуры адгезивных клеток. Современные проблемы науки и образования. 2017;(5) [электронный ресурс]. Доступно на: https://scienceeducation.ru/ru/article/view?id=26800 (дата обращения: 29.09.2017).
2. Popescu G, Park Y. Quantitative phase imaging in biomedicine. J Biomed Opt. 2015;20(11): 111201. doi: 10.1117/1.JBO.20.11.111201.
3. Лопарев АВ, Игнатьев ПС, Индукаев КВ, Осипов ПА, Мазалов ИН, Козырев АВ. Высокоскоростной модуляционный интерференционный микроскоп для медико-биологических исследований. Измерительная техника. 2009;(11):60–4.
4. Бункин НФ, Суязов HB, Шкирин AB, Игнатьев ПС, Индукаев КВ. Определение микроструктуры газовых пузырьков в глубоко очищенной воде по измерениям элементов матрицы рассеяния лазерного излучения. Квантовая электроника. 2009;39(4):367–81. doi: 10.1070/QE2009v039n04ABEH013892.
5. Yang SA, Yoon J, Kim K, Park Y. Measurements of morphological and biophysical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry A. 2017;91(5):510–8. doi: 10.1002/cyto.a.23110.
6. Василенко ИА, Кардашова ЗЗ, Тычинский ВП, Вишенская ТВ, Лифенко РА, Валов АЛ, Иванюта ИВ, Агаджанян БЯ. Клеточная диагностика: возможности витальной компьютерной микроскопии. Вестник последипломного медицинского образования. 2009;(3–4):64–8.
7. Иванова ЕВ, Щербакова ЭГ, Рабинович ОФ, Барсуков АА, Ежова ЕГ, Василенко ИА. Современные подходы к патогенетической терапии плоского лишая слизистой оболочки рта. Стоматология. 2005;84(5):28–31.
8. Evans AA, Bhaduri B, Popescu G, Levine AJ. Geometric localization of thermal fluctuations in red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(11):2865–70. doi: 10.1073/pnas.1613204114.
9. Арсенюк АЮ, Павлова ИБ, Игнатьев ПС. Исследование процесса L-трансформации в популяции сальмонелл методами электронной лазерной интерференционной микроскопии. Сельскохозяйственная биология. 2013;48(6):55–60. doi: 10.15389/agrobiology.2013.6.55rus.
10. Тычинский ВП, Николаев ЮА, Лисовский ВВ, Кретушев АВ, Вышенская ТВ, Мулюкин АЛ, Сузина НА, Дуда ВИ, Эль-Регистан ГИ. Исследования ранних стадий прорастания спор Bacillus licheniformis методом динамической фазовой микроскопии. Микробиология. 2007;76(2):191–9.
11. Власова ЕА, Василенко ИА, Суслов ВП, Пашкин ИН. Динамика морфометрических показателей тромбоцитов периферической крови как критерий оценки тромбогенности диализных мембран. Урология. 2011;(2): 36–41.
12. Кулагина ЛН, Болтовская ВВ, Долгушкин ДА, Нефедова ИФ, Россинская ВВ, авторы; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, патентообладатель. Способ обработки предметных стекол с зеркальным покрытием. Пат. 2639768 Рос. Федерация. Опубл. 22.12.2017.
13. Tychinsky V, Kretushev AV, Klemyashov IV, Zverzhkhovskiy VD, Vyshenskaya TV, Shtil AA. Quantitative phase imaging of living cells: application of the phase volume and area functions to the analysis of "nucleolar stress". J Biomed Opt. 2013;18(11):111413. doi: 10.1117/1.JBO.18.11.111413.
Almanac of Clinical Medicine. 2018; 46: 778-783
The use of the interference microscopy to study structural characteristics of cultured dermal fibroblasts
https://doi.org/10.18786/2072-0505-2018-46-8-778-783Abstract
Rationale: The use of electron, nuclear power and confocal microscopy for the screening of biologically active compounds, medical products and express diagnostics of some diseases at the cell level is associated with laborand time-consuming sample preparation, which cannot exclude potential measurement errors and artifacts. The modulation interference microscopy does not have these disadvantages; it allows for non-invasive studies of cell structures, imaging with nanometer resolution and analysis of the optical properties of an object.
Aim: To assess the potential of the interference microscopy in the evaluation of morphofunctional characteristics of in vitro mitomycin conditioned cultured cell nuclei (dermal fibroblasts taken as a model).
Materials and methods: Native culture of human dermal fibroblasts of the 6th passage, grown on glass with mirror coating in the cell culture laboratory of the Institute of Experimental Medicine and Biotechnology of Samara State Medical University (Russia), was examined with a modulation interference microscope MIM-340 (JSC PA UOMZ, Russia). Changes over time in the structural characteristics of dermal fbroblast nuclei conditioned with mitomycin were evaluated. The control group included fibroblasts cultured in the same conditions on glass with mirror coating without mitomycin. Imaging with MIM-340 was done at three hours, one and four days after adding the cytostatic. The control group was assessed at the same time points.
Results: We have shown that the cell culture grown on dielectric glasses does not differ in its morphofunctional characteristics from the culture grown on culture plastics. This proves the possibility to study the adhesive native culture using interference microscopy. We have found that the cells respond to a single mitomycin 0.04% exposure with a change to a globular shape and a sharp increase in the nuclear phase thickness (217.8 vs. 142.18 nm in the control group, p ≤ 0.05). Thereafter, the morphofunctional characteristics of the cells are restored, which is confirmed by the changes over time in the culture density, cell shape and size, and the phase thickness of the nucleus.
Conclusion: The results obtained make it possible to recommend the method of modulation interference microscopy for evaluation of toxicity and biocompatibility of drugs, medical products and physical factors for diagnosis and treatment.
References
1. Nefedova IF, Rossinskaya VV, Volova LT, Boltovskaya VV, Kulagina LN. Ispol'zovanie vozmozhnostei interferentsionnoi mikroskopii dlya izucheniya kul'tury adgezivnykh kletok. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2017;(5) [elektronnyi resurs]. Dostupno na: https://scienceeducation.ru/ru/article/view?id=26800 (data obrashcheniya: 29.09.2017).
2. Popescu G, Park Y. Quantitative phase imaging in biomedicine. J Biomed Opt. 2015;20(11): 111201. doi: 10.1117/1.JBO.20.11.111201.
3. Loparev AV, Ignat'ev PS, Indukaev KV, Osipov PA, Mazalov IN, Kozyrev AV. Vysokoskorostnoi modulyatsionnyi interferentsionnyi mikroskop dlya mediko-biologicheskikh issledovanii. Izmeritel'naya tekhnika. 2009;(11):60–4.
4. Bunkin NF, Suyazov HB, Shkirin AB, Ignat'ev PS, Indukaev KV. Opredelenie mikrostruktury gazovykh puzyr'kov v gluboko ochishchennoi vode po izmereniyam elementov matritsy rasseyaniya lazernogo izlucheniya. Kvantovaya elektronika. 2009;39(4):367–81. doi: 10.1070/QE2009v039n04ABEH013892.
5. Yang SA, Yoon J, Kim K, Park Y. Measurements of morphological and biophysical alterations in individual neuron cells associated with early neurotoxic effects in Parkinson's disease. Cytometry A. 2017;91(5):510–8. doi: 10.1002/cyto.a.23110.
6. Vasilenko IA, Kardashova ZZ, Tychinskii VP, Vishenskaya TV, Lifenko RA, Valov AL, Ivanyuta IV, Agadzhanyan BYa. Kletochnaya diagnostika: vozmozhnosti vital'noi komp'yuternoi mikroskopii. Vestnik poslediplomnogo meditsinskogo obrazovaniya. 2009;(3–4):64–8.
7. Ivanova EV, Shcherbakova EG, Rabinovich OF, Barsukov AA, Ezhova EG, Vasilenko IA. Sovremennye podkhody k patogeneticheskoi terapii ploskogo lishaya slizistoi obolochki rta. Stomatologiya. 2005;84(5):28–31.
8. Evans AA, Bhaduri B, Popescu G, Levine AJ. Geometric localization of thermal fluctuations in red blood cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(11):2865–70. doi: 10.1073/pnas.1613204114.
9. Arsenyuk AYu, Pavlova IB, Ignat'ev PS. Issledovanie protsessa L-transformatsii v populyatsii sal'monell metodami elektronnoi lazernoi interferentsionnoi mikroskopii. Sel'skokhozyaistvennaya biologiya. 2013;48(6):55–60. doi: 10.15389/agrobiology.2013.6.55rus.
10. Tychinskii VP, Nikolaev YuA, Lisovskii VV, Kretushev AV, Vyshenskaya TV, Mulyukin AL, Suzina NA, Duda VI, El'-Registan GI. Issledovaniya rannikh stadii prorastaniya spor Bacillus licheniformis metodom dinamicheskoi fazovoi mikroskopii. Mikrobiologiya. 2007;76(2):191–9.
11. Vlasova EA, Vasilenko IA, Suslov VP, Pashkin IN. Dinamika morfometricheskikh pokazatelei trombotsitov perifericheskoi krovi kak kriterii otsenki trombogennosti dializnykh membran. Urologiya. 2011;(2): 36–41.
12. Kulagina LN, Boltovskaya VV, Dolgushkin DA, Nefedova IF, Rossinskaya VV, avtory; FGBOU VO SamGMU Minzdrava Rossii, patentoobladatel'. Sposob obrabotki predmetnykh stekol s zerkal'nym pokrytiem. Pat. 2639768 Ros. Federatsiya. Opubl. 22.12.2017.
13. Tychinsky V, Kretushev AV, Klemyashov IV, Zverzhkhovskiy VD, Vyshenskaya TV, Shtil AA. Quantitative phase imaging of living cells: application of the phase volume and area functions to the analysis of "nucleolar stress". J Biomed Opt. 2013;18(11):111413. doi: 10.1117/1.JBO.18.11.111413.
