Альманах клинической медицины. 2015; : 12-18
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ ГЕНА PIK3CA С ПОМОЩЬЮ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОЙ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ И ЕГО ВАЛИДАЦИЯ В ОПУХОЛЯХ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
https://doi.org/10.18786/2072-0505-2015-41-12-18Аннотация
Цель – разработать высокочувствительную систему для выявления соматических мутаций в кодонах 542 и 545 экзона 9 и в кодоне 1047 экзона 20 гена PIK3CA, составляющих более 80% всех соматических мутаций этого гена, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени для работы с гистологическим материалом без проведения макро и микродиссекции и произвести анализ ассоциаций этих мутаций с клиническими и морфологическими характеристиками опухолей молочной железы.
Материал и методы. Применен метод аллель-специфичной ПЦР с детекцией сигнала с помощью TaqMan зондов. Для определения его аналитической чувствительности стандартными генно-инженерными методами с использованием мутагенеза были сконструированы плазмиды, несущие исследуемые мутации, приготовлены образцы ДНК, несущие разный процент мутации относительно дикого типа (5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,25%).
Результаты. Проведена разработка и оптимизация мультиплексной аллель-специфичной ПЦР в режиме реального времени для выявления наиболее распространенных соматических мутаций в гене PIK3CA: p.E542K c.1624G>A, p.E545K c.1633G>A, p.H1047R c.3140A>G,p.H1047L c.3140A>T. Аналитическая чувствительность выявления мутаций составила 0,5% для p.E542K и 0,25% для p.E545K, p.H1047R и H1047L. Разработанный метод был использован для выявления указанных соматических мутаций в ДНК, выделенной из парафиновых блоков опухолей больных раком молочной железы. Показано, что частота встречаемости соматических мутаций гена PIK3CA увеличивается по мере прогрессии опухоли – 9,6% в опухолях I–II стадии против 21% в опухолях III–IV стадии (83 и 324 образца соответственно, p = 0,022) в основном за счет увеличения встречаемости мутации p.H1047R c.3140A>G, локализованной в каталитическом домене фермента.
Заключение. Разработанный метод детекции соматических мутаций в гене PIK3CA является достаточно чувствительным, специфичным и производительным, что позволяет рекомендовать данную методику для потокового скрининга в клинико-диагностической лаборатории с целью прогнозирования течения заболевания, мониторинга ответа опухоли на терапию и ее коррекции.
Список литературы
1. Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, Silliman N, Ptak J, Szabo S, Yan H, Gazdar A, Powell SM, Riggins GJ, Willson JK, Markowitz S, Kinzler KW, Vogelstein B, Velculescu VE. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 2004;304(5670):554.
2. Karakas B, Bachman KE, Park BH. Mutation of the PIK3CA oncogene in human cancers. Br J Cancer. 2006;94(4):455–9.
3. COSMIC database http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic
4. Zhao L, Vogt PK. Class I PI3K in oncogenic cellular transformation. Oncogene. 2008;27(41):5486– 96. doi: 10.1038/onc.2008.244.
5. Gustin JP, Karakas B, Weiss MB, Abukhdeir AM, Lauring J, Garay JP, Cosgrove D, Tamaki A, Konishi H, Konishi Y, Mohseni M, Wang G, Rosen DM, Denmeade SR, Higgins MJ, Vitolo MI, Bachman KE, Park BH. Knockin of mutant PIK3CA activates multiple oncogenic pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(8):2835–40. doi: 10.1073/ pnas.0813351106.
6. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989;17(7):2503–16.
7. Board RE, Thelwell NJ, Ravetto PF, Little S, Ranson M, Dive C, Hughes A, Whitcombe D. Multiplexed assays for detection of mutations in PIK3CA. Clin Chem. 2008;54(4):757–60. doi: 10.1373/clinchem.2007.098376.
8. Li B, Kadura I, Fu DJ, Watson DE. Genotyping with TaqMAMA. Genomics. 2004;83(2):311–20.
9. Pang H, Flinn R, Patsialou A, Wyckoff J, Roussos ET, Wu H, Pozzuto M, Goswami S, Condeelis JS, Bresnick AR, Segall JE, Backer JM. Differential enhancement of breast cancer cell motility and metastasis by helical and kinase domain mutations of class IA phosphoinositide 3-kinase. Cancer Res. 2009;69(23):8868–76. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-1968.
10. Miled N, Yan Y, Hon WC, Perisic O, Zvelebil M, Inbar Y, Schneidman-Duhovny D, Wolfson HJ, Backer JM, Williams RL. Mechanism of two classes of cancer mutations in the phosphoinositide 3-kinase catalytic subunit. Science. 2007;317(5835):239–42.
11. Chakrabarty A, Rexer BN, Wang SE, Cook RS, Engelman JA, Arteaga CL. H1047R phosphatidylinositol 3-kinase mutant enhances HER2-mediated transformation by heregulin production and activation of HER3. Oncogene. 2010;29(37):5193–203. doi: 10.1038/onc.2010.257.
Almanac of Clinical Medicine. 2015; : 12-18
DEVELOPMENT OF A MULTIPLEX ALLELE-SPECIFIC REAL-TIME PCR METHOD FOR DETECTION OF PIK3CA GENE SOMATIC MUTATIONS AND ITS VALIDATION IN THE TUMORS OF BREAST CANCER PATIENTS
https://doi.org/10.18786/2072-0505-2015-41-12-18Abstract
Aim: To develop a highly sensitive real-time polymerase chain reaction (PCR) system for detection of somatic mutations in 542 and 545 codons of exon 9 and 1047 codon of exon 20 of PIK3CA gene comprising more than 80% of all somatic mutations in this gene for application on histological material without macroand microdissection, and to analyze associations between these mutations and clinical and pathological characteristics of breast tumors.
Materials and methods: The Allele-specific real-time PCR method with signal detection by TaqMan probes was used. For determination of its analytical sensitivity, plasmids carrying the mutations studied were constructed by standard genetic engineering methods using mutagenesis. DNA samples carrying various mutated/wild type DNA ratios (5.0; 2.0; 1.0; 0.5, 0.25%) were prepared. Results: Multiplex allele-specific real-time PCR method for detection of most common mutations in PIK3CA gene: p.E542K c.1624G>A, p.E545K c.1633G>A, p.H1047R c.3140A>G, p.H1047L c.3140A>T – was developed and optimized.
Analytical sensitivity of mutation detection comprised 0.5% for p.E542K and 0.25% for p.E545K, p.H1047R and H1047L enzyme.
Conclusion: The method developed for detection of somatic mutations in PIK3CA gene is sufficiently sensitive, specific and efficient, that allows to propose it for a routine screening in clinical diagnostic laboratories for evaluation of disease prognosis and monitoring of response to therapy and its modification.
References
1. Samuels Y, Wang Z, Bardelli A, Silliman N, Ptak J, Szabo S, Yan H, Gazdar A, Powell SM, Riggins GJ, Willson JK, Markowitz S, Kinzler KW, Vogelstein B, Velculescu VE. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 2004;304(5670):554.
2. Karakas B, Bachman KE, Park BH. Mutation of the PIK3CA oncogene in human cancers. Br J Cancer. 2006;94(4):455–9.
3. COSMIC database http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic
4. Zhao L, Vogt PK. Class I PI3K in oncogenic cellular transformation. Oncogene. 2008;27(41):5486– 96. doi: 10.1038/onc.2008.244.
5. Gustin JP, Karakas B, Weiss MB, Abukhdeir AM, Lauring J, Garay JP, Cosgrove D, Tamaki A, Konishi H, Konishi Y, Mohseni M, Wang G, Rosen DM, Denmeade SR, Higgins MJ, Vitolo MI, Bachman KE, Park BH. Knockin of mutant PIK3CA activates multiple oncogenic pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(8):2835–40. doi: 10.1073/ pnas.0813351106.
6. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith JC, Markham AF. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 1989;17(7):2503–16.
7. Board RE, Thelwell NJ, Ravetto PF, Little S, Ranson M, Dive C, Hughes A, Whitcombe D. Multiplexed assays for detection of mutations in PIK3CA. Clin Chem. 2008;54(4):757–60. doi: 10.1373/clinchem.2007.098376.
8. Li B, Kadura I, Fu DJ, Watson DE. Genotyping with TaqMAMA. Genomics. 2004;83(2):311–20.
9. Pang H, Flinn R, Patsialou A, Wyckoff J, Roussos ET, Wu H, Pozzuto M, Goswami S, Condeelis JS, Bresnick AR, Segall JE, Backer JM. Differential enhancement of breast cancer cell motility and metastasis by helical and kinase domain mutations of class IA phosphoinositide 3-kinase. Cancer Res. 2009;69(23):8868–76. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-09-1968.
10. Miled N, Yan Y, Hon WC, Perisic O, Zvelebil M, Inbar Y, Schneidman-Duhovny D, Wolfson HJ, Backer JM, Williams RL. Mechanism of two classes of cancer mutations in the phosphoinositide 3-kinase catalytic subunit. Science. 2007;317(5835):239–42.
11. Chakrabarty A, Rexer BN, Wang SE, Cook RS, Engelman JA, Arteaga CL. H1047R phosphatidylinositol 3-kinase mutant enhances HER2-mediated transformation by heregulin production and activation of HER3. Oncogene. 2010;29(37):5193–203. doi: 10.1038/onc.2010.257.
