Офтальмохирургия. 2019; : 27-32
Первый опыт трансплантации 3D-сфероидов ретинального пигментного эпителия в эксперименте
https://doi.org/10.25276/0235-4160-2019-1-27-32Аннотация
Актуальность. На сегодняшний день традиционные методики лечения тяжелых форм возрастной макулярной дегенерации (ВМД) не всегда позволяют добиться значимого улучшения зрения.
Новым перспективным методом лечения ВМД является трансплантация ретинального пигментного эпителия (РПЭ).
По нашему мнению, наиболее современной формой трансплантата РПЭ является многоклеточный сфероид - это форма 3D-клеточной культуры, в которой клетки приближены к условиям нативной ткани.
Однако трансплантация РПЭ в форме 3D-сфероидов требует проведения доклинических исследований.
Цель. Разработать технику трансплантации 3D-сфероидов РПЭ на глазах экспериментальных животных (кролики).
Материал и методы. 1. Этап исследований in vitro. Для иммуноцитохимического исследования полученные 3D-культуры сфероидов изучали на 3-е, 7-е и 11-е сутки сфероидогенеза (лазерный сканирующий конфокальный микроскоп «Fluo View FV10i», Olympus, Япония). Оценивали экспрессию характерных эпителиальных маркеров (Alexa Fluor, Великобритания), таких как: RPE-65, ZO-1, Цитокератин 8, 18, а также мезенхимального маркера Виментина.
2. Этап исследований in vivo. Всем кроликам (n=10) выполняли витрэктомию (2500 резов в минуту, вакуум 600 мм рт.ст.), (Alcon, Accurus, США). Далее острой канюлей 39G делали ретинотомическое отверстие выше места центральной зоны сетчатки и субретинально вводили сфероиды РПЭ (MicroDose injection kit 1 ml, Med One, США). Операции заканчивались заменой жидкости на воздух и наложением швов на склеральные разрезы и конъюнктиву.
Методы послеоперационного контроля: ультразвуковое В-скани- рование глаза (Ultrasonic UD-6000, Tomey, Япония) и оптическая когерентная томография (ОКТ), (Askin Spectralis, Heidelberg engineering, Германия).
Животные выводились из эксперимента на 7, 10, 14 и 20 сутки наблюдения путем воздушной эмболии. Глазные яблоки энуклеировались для последующего гистологического исследования.
Результаты. 1. Этап исследований in vitro. При проведении иммуноцитохимического окрашивания полученных 3D-культур отмечалось наличие ярко выраженной экспрессии характерного высокоспецифичного маркера пигментного эпителия сетчатки RPE-65, а также эпителиальных маркеров Цитокератина 8, 18 и ZO-1. Экспрессия мезенхимального маркера Виментина была слабой, что свидетельствует о преимуществе 3D-культивирования эпителиальных клеток для сохранения их эпителиального фенотипа.
2. Этап исследований in vivo. При проведении ультразвукового В-сканирования в 1 сутки у 6 кроликов отмечалась плоская отслойка сетчатки в зоне оперативного вмешательства высотой до 1 мм, у 4 кроликов отмечалось прилегание оболочек, отслойка сетчатки не визуализировалась.
ОКТ-картина морфологического состояния сетчатки была схожей у всех экспериментальных животных - в течение первых 7 суток после хирургии в зоне оперативного вмешательства отмечался кистозный отек и плоская отслойка сетчатки. По мере наблюдения сетчатка прилегала и отек сетчатки уменьшался. Также на 3, 7 и 10 сутки субретинально обнаруживались округлые конгломераты диаметром от 60 до 80 мкм - предположительно 3D-сфероиды РПЭ. При проведении ОКТ на 14 и 20 сутки значимых изменений морфологического состояния сетчатки не наблюдалось.
По данным гистологического исследования отмечалась адгезия сфероидов РПЭ к сосудистой оболочке с последующим распластыванием и образованием нового клеточного слоя по мере увеличения сроков наблюдения.
Выводы. 1. Предложенная технология культивирования кроличьего РПЭ с последующим конструированием 3D-сфероидов позволяет сохранить эпителиальный фенотип клеток, что подтверждается данными иммуноцитохимических исследований.
- Разработанная хирургическая техника трансплантации РПЭ является приемлемой, что подтверждается данными оптической когерентной томографии и гистологическими исследованиями.
- Предложенная хирургическая техника субретинальной трансплантации 3D-сфероидов РПЭ является перспективной для дальнейших экспериментальных исследований с целью внедрения в клиническую практику.
Список литературы
1. Yannuzzi L.A., Friedman R., Fine S.L. et al. Symposium on age-related macular degeneration. Bull N Y Acad Med. 1988;64(9): 955-1013.
2. Либман Е.С., Шахова Е.В. Слепота, слабови- дение и инвалидность по зрению в Российской Фе-дерации. Российский межрегиональный симпозиум «Ликвидация устранимой слепоты: Всемирная ини-циатива ВОЗ». Материалы. М.; 2003: 38-42.
3. Балашова Л.М. Витаминно-минеральные комплексы и здоровье глаз. Русский медицинский журнал. Клиническая офтальмология. 2008;9(1): 41- 45.
4. Eyetech Study Group. Anti-vascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration: phase II study results. Ophthalmology. 2003;110(5): 979-986. Available from: https://doi. org/10.1016/S0161-6420(03)00085-X.
5. Бикбов М.М., Файзрахманов Р.Р. Оператив¬ное лечение пациентов с фиброваскулярными мем¬бранами при макулярной дегенерации с частич¬ным восстановлением пигментного эпителия сет¬чатки. Современные технологии в офтальмоло¬гии. 2017;1: 35-38.
6. Schmidt-Erfurth U., Hasan T., Gragoudas E. et al. Vascular targeting in photodynamic occlusion of subretinal vessels. Ophthalmology. 1994;101(12): 1953¬1961.
7. Binder S., Stolba U., Krebs I. et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am. J. Ophthalmol. 2002;133(2): 215-225.
8. Falkner-Radler C.I., Krebs I., Glittenberg K. et al. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomized clinical study. Br. J. Ophthalmol. 2011;95: 370-375. Available from: https://doi.org/10.1136/bjo.2009.176305.
9. Bindewald A., Roth F., Van Meurs J., Holz F.G. Transplantation of retinal pigment pithelium (RPE) following CNV removal in patients with AMD. Techniques, results, outlook. Ophthalmologie. 2004;101(9): 886-894. Available from: https://doi. org/10.1007/s00347-004-1077-2.
10. Zhao C., Boles N.C., Miller J.D. et al. Stern Development of a Refined protocol for trans - scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J. Visualized Experiments. 126:e55220. Available from: https://doi. org/10.3791/55220.
11. Борзенок С.А., Кошелева А.В., Попов И.А.. и др. 3D-культивирование ретинального пигментного эпителия трупных донорских глаз человека на предтрансплантационном этапе. VII Всероссийский съезд трансплантологов. Материалы съезда. М.; 2014: 262-263.
12. Algvere P.V., Berglin L., Gouras P. et al. Transplantation of RPE in age-related macular degeneration: observations in disciform lesions and dry RPE atrophy. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1997;235(3): 149-158.
13. Del Priore L.V., Kaplan H.J., Tezel T.H. et al. Retinal pigment epithelial cell transplantation after subfoveal membranectomy in age-related macular degeneration: clinicopathologic correlation. Am. J. Ophthalmol. 2001;131(4): 472-480.
14. Nita M., Strzalka-Mrozik B., Grzybowski A. et al. Ophthalmic transplantology: posterior segment of the eye - part II. MedSciMonit. 2012;18(6): RA97-103.
15. Binder S., Krebs I., Hilgers R.D. et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004;45(11): 4151-4160. Available from: https://doi.org/10.1167/iovs.04-0118.
16. Caramoy A., Liakopoulos S., Kirchhof B. Recurrence of choroidal neovascular membrane after autologous transplantation of RPE and choroid for neovascular AMD. Acta Ophthalmol. 2011;89(8): 666-668. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1755-3768.2010.02018.x.
17. Van Meurs J.C., Averst E., Hofland L.J. et al. Autologous peripheral retinal pigment epithelium translocation in patients with subfoveal neovascular membranes. Br.J.Ophthalmol. 2004;88: 110-113.
Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery. 2019; : 27-32
The first experience of 3D spheroids retinal pigment epithelium transplantation in the experiment
https://doi.org/10.25276/0235-4160-2019-1-27-32Abstract
Introduction. Available methods in the treatment of age-related macular degeneration (AMD) do not always lead to significant vision improvement.
A new advanced method of AMD treatment is transplantation of retinal pigment epithelium (RPE) in the form of cell suspension or choroidal pigment complex.
In our opinion, the most modern form of RPE transplant is a multicellular spheroid - the form of 3D cell culture in which cells are close to the conditions of native tissue.
However, transplantation of 3D spheroids of RPE requires preclinical studies.
Purpose. This research is aimed to devise the technique for transplantation of RPE 3D spheroids in the eyes of experimental animals (rabbits).
Material and methods. 1. In vitro research phase. For immunocytochemical tests the 3D spheroids were explored on the 3rd, 7th, and 11th day of steroidogenesis (using the laser scanning confocal microscope «Fluo View FV10i», Olympus, Japan). The expression of epithelial markers (Alexa Fluor, Great Britain), such as: RPE65, ZO-1, Cytokeratin 8, 18, and Vimentin (the mesenchymal marker) was analyzed.
2. In vivo research phase. Vitrectomy (2500 cuts per minute, vacuum 600 mmHg), (Alcon, Accurus, USA) was performed on all rabbits (n=10). Then, a sharp cannula 39G was used to make a retinotomy above the central zone of retina, and spheroids (n=81) were injected (MicroDose injection kit 1 ml, Med One, USA) in subretinal space. The operation ended with the replacement of fluid into air and suturing scleral incision and the conjunctiva. The following methods of control were used: ultrasound B-scan (Ultrasonic UD-6000, Tomey, Japan) and optical coherence tomography (OCT) - (Askin Spectralis, Heidelberg engineering, Germany).
Animals were taken out of the experiment on days 7, 10, 14 and 20 by air embolism. The eyeballs were enucleated for a subsequent histological examination.
Results. 1. In vitro research phase. During immunocytochemical tests on the obtained 3D cultures, the presence of high expression of specific marker of retinal pigment epithelium RPE-65, also epithelial markers Cytokeratin 8, 18 and ZO-1 was noted. The expression of mesenchymal marker Vimentin was weak - that indicates the advantage of 3D cultivation of RPE cells to keep their phenotype. This indicates the advantage of 3D cultivation of epithelial cells to preserve their epithelial phenotype.
2. In vivo research phase. On day 1 during ultrasonic B-scanning in 6 rabbits there was observed a flat retinal detachment in the area of surgical intervention height up to 1 mm; in 4 rabbits there was detected adhesion of the membranes, detachment of retina was not visible.
The picture of the morphological state during retinal OCT was similar in all experimental animals - during the first 7 days after surgery cystic edema was noted and also a flat retinal detachment in the surgery area. As we observed, the retina was attaching and retinal edema was decreasing. Also, on day 3, 7 and 10 we revealed subretinal round conglomerates with a diameter of 60 to 80 pm - presumably RPE 3D spheroids. No morphological changes of the retina were seen on day 14 and day 20.
According to histological findings, there was found adhesion of the RPE spheroids to the choroid with subsequent spreading and formation of a new cell layer with an increase of follow-up periods.
Conclusion. 1. The proposed technology of cultivation of rabbit RPE with subsequent construction of 3D spheroids allows to preserve the epithelial phenotype of cells, that is confirmed by immunocytochemical tests.
2. The developed surgical technique of RPE transplantation is acceptable, that is confirmed by the OCT and histological investigation.
3. The proposed surgical technique of subretinal transplantation of 3D spheroids of RPE is promising for further experimental studies to be implemented in clinical practice.References
1. Yannuzzi L.A., Friedman R., Fine S.L. et al. Symposium on age-related macular degeneration. Bull N Y Acad Med. 1988;64(9): 955-1013.
2. Libman E.S., Shakhova E.V. Slepota, slabovi- denie i invalidnost' po zreniyu v Rossiiskoi Fe-deratsii. Rossiiskii mezhregional'nyi simpozium «Likvidatsiya ustranimoi slepoty: Vsemirnaya ini-tsiativa VOZ». Materialy. M.; 2003: 38-42.
3. Balashova L.M. Vitaminno-mineral'nye kompleksy i zdorov'e glaz. Russkii meditsinskii zhurnal. Klinicheskaya oftal'mologiya. 2008;9(1): 41- 45.
4. Eyetech Study Group. Anti-vascular endothelial growth factor therapy for subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration: phase II study results. Ophthalmology. 2003;110(5): 979-986. Available from: https://doi. org/10.1016/S0161-6420(03)00085-X.
5. Bikbov M.M., Faizrakhmanov R.R. Operativ¬noe lechenie patsientov s fibrovaskulyarnymi mem¬branami pri makulyarnoi degeneratsii s chastich¬nym vosstanovleniem pigmentnogo epiteliya set¬chatki. Sovremennye tekhnologii v oftal'molo¬gii. 2017;1: 35-38.
6. Schmidt-Erfurth U., Hasan T., Gragoudas E. et al. Vascular targeting in photodynamic occlusion of subretinal vessels. Ophthalmology. 1994;101(12): 1953¬1961.
7. Binder S., Stolba U., Krebs I. et al. Transplantation of autologous retinal pigment epithelium in eyes with foveal neovascularization resulting from age-related macular degeneration: a pilot study. Am. J. Ophthalmol. 2002;133(2): 215-225.
8. Falkner-Radler C.I., Krebs I., Glittenberg K. et al. Human retinal pigment epithelium (RPE) transplantation: outcome after autologous RPE-choroid sheet and RPE cell-suspension in a randomized clinical study. Br. J. Ophthalmol. 2011;95: 370-375. Available from: https://doi.org/10.1136/bjo.2009.176305.
9. Bindewald A., Roth F., Van Meurs J., Holz F.G. Transplantation of retinal pigment pithelium (RPE) following CNV removal in patients with AMD. Techniques, results, outlook. Ophthalmologie. 2004;101(9): 886-894. Available from: https://doi. org/10.1007/s00347-004-1077-2.
10. Zhao C., Boles N.C., Miller J.D. et al. Stern Development of a Refined protocol for trans - scleral subretinal transplantation of human retinal pigment epithelial cells into rat eyes. J. Visualized Experiments. 126:e55220. Available from: https://doi. org/10.3791/55220.
11. Borzenok S.A., Kosheleva A.V., Popov I.A.. i dr. 3D-kul'tivirovanie retinal'nogo pigmentnogo epiteliya trupnykh donorskikh glaz cheloveka na predtransplantatsionnom etape. VII Vserossiiskii s\"ezd transplantologov. Materialy s\"ezda. M.; 2014: 262-263.
12. Algvere P.V., Berglin L., Gouras P. et al. Transplantation of RPE in age-related macular degeneration: observations in disciform lesions and dry RPE atrophy. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 1997;235(3): 149-158.
13. Del Priore L.V., Kaplan H.J., Tezel T.H. et al. Retinal pigment epithelial cell transplantation after subfoveal membranectomy in age-related macular degeneration: clinicopathologic correlation. Am. J. Ophthalmol. 2001;131(4): 472-480.
14. Nita M., Strzalka-Mrozik B., Grzybowski A. et al. Ophthalmic transplantology: posterior segment of the eye - part II. MedSciMonit. 2012;18(6): RA97-103.
15. Binder S., Krebs I., Hilgers R.D. et al. Outcome of transplantation of autologous retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: a prospective trial. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004;45(11): 4151-4160. Available from: https://doi.org/10.1167/iovs.04-0118.
16. Caramoy A., Liakopoulos S., Kirchhof B. Recurrence of choroidal neovascular membrane after autologous transplantation of RPE and choroid for neovascular AMD. Acta Ophthalmol. 2011;89(8): 666-668. Available from: https://doi.org/10.1111/j.1755-3768.2010.02018.x.
17. Van Meurs J.C., Averst E., Hofland L.J. et al. Autologous peripheral retinal pigment epithelium translocation in patients with subfoveal neovascular membranes. Br.J.Ophthalmol. 2004;88: 110-113.
