Офтальмохирургия. 2017; : 28-36
ПРЕДОПЕРАЦИОННАЯ ПОДГОТОВКА КЛЕТОЧНЫХ ТРАНСПЛАНТАТОВ ЛИМБА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПТИЧЕСКИХ НЕЙРОПАТИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)
https://doi.org/10.25276/0235-4160-2017-2-28-36Аннотация
Цель. Изучить в эксперименте in vitro секрецию фактора роста нервов (ФРН) и нейроростового фактора головного мозга (НФГМ) интактными и индуцированными мультипотентными мезенхимальными стволовыми клетками лимба (ММСК) в трехмерной культуре (3D).
Материал и методы. ММСК получали путем культивирования фрагментов лимба, выделенных из трупных донорских глаз человека согласно медицинской технологии Глазного тканевого банка ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России. Фенотип полученной клеточной культуры изучали с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Стимуляцию секреции нейротрофических факторов проводили по двухэтапной методике с использованием неспецифических факторов активации: EGF, hbFGF, добавка N2, дибутирил цАМФ, NRG1-beta 1, PDGF, 3-изобутил-1-метилксантин. 3D-клеточные сфероиды создавали с использованием агарозных планшетов (3D Petri dishes, Microtissue, США) для трех групп сравнения, где I группа – контрольная, II группа – с индукцией сфероидов на 1 сутки культивирования; III группа – с индукцией сфероидов на 7 сутки культивирования. Концентрацию ФРН и НФГМ в среде культивирования изучали методом иммуноферментного анализа (ИФА).
Результаты. Индукция 3D-сфероидов ММСК лимба, проведенная на 1 и 7 сутки инкубирования, способствует значительному увеличению продукции ФРН и НФГМ, однако в дальнейшем наблюдается выраженное снижение секреции этих факторов. Проведение индукции приводит к изменению морфологии сфероидов: потере компактности, появлению «бахромчатости» (дебриса). Подобные изменения свидетельствуют о нежизнеспособности полученных 3D-клеточных сфероидов.
Заключение. Клеточные сфероиды, созданные из 2D-культуры интактных ММСК лимба методом трехмерного культивирования, способны в достаточных терапевтических концентрациях спонтанно синтезировать ФРН и НФГМ, являются наиболее оптимальной конструкцией для трансплантации в экстрабульбарные и интраокулярные тканевые ниши глазного яблока, являются потенциальным источником пролонгированной секреции нейроростовых факторов в клеточной терапии оптических нейропатий.
Список литературы
1. Борзенок С.А., Онищенко Н.А., Тонаева Х.Д. и др. Сотрансплантация ММСК-подобных клеток лимба способствует местной иммунокоррекции и прозрачному приживлению трансплантата роговицы при кератопластике высокого риска // Вестник трансплантологии и искусственных органов. – 2014. – Т. XVI, № 1. – С. 12-20.
2. Гомазков О.А. Старение мозга и нейротрофическая терапия. – М.: ИКАР, 2011. – 92 с.
3. Горкун А.А. Изучение индуцированного васкулогенеза в 3D культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток пупочного канатика: Автореф. дис. … канд. биол. наук. – М., 2012. – 25 с.
4. Егоров Е.А., Брежнев A.Ю., Егоров А.Е. Нейропротекция при глаукоме: современные возможности и перспективы // РМЖ «Клиническая офтальмология». – 2014. – № 2. – С. 108-112.
5. Патент РФ № 2475218. Способ выделения и органотипического культивирования аллогенного лимбального трансплантата / Борзенок С.А., Малюгин Б.Э., Тонаева Х.Д., Онищенко Н.А., Комах Ю.А., Ковшун Е.В.; Заявитель и патентообладатель ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России»; Заявл. 06.12.2011 г.; Опубл. 20.02.2013 г. // Бюл. – 2013. – № 5. – 13 с.
6. Baer P.C., Griesche N., Luttmann W. et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro: evaluation of an optimal expansion medium preserving stemness // Cytotherapy. – 2010. – Vol. 12. – P. 96-106.
7. Baraniak P.R., McDevitt T.C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential // Cell Tissue Res. – 2012. – Vol. 347, № 3. – P. 701-711.
8. Crigler L., Robey R. C., Asawachaicharn A. et al. Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis. // Exp. Neurol. – 2006. – 198 (1). – P. 54-64.
9. Flammer J., Haefliger I., Orgul S. Vascular dysregulation: a principal risk factor for glaucomatous damage? // J. Glaucoma. – 1999. – Vol. 8. – P. 212-219.
10. Gnecchi M., He H., Liang O.D. et al. Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells // Nat. Med. – 2005. – Vol. 11, № 4. – P. 367-368.
11. Harper M.M., Grozdanic S.D., Blits B. et al. Transplantation of BDNF secreting mesenchymal stemcells provides neuroprotection in chronically hypertensiverat eyes // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2011. – Vol. 52, № 7. – P. 4506-4515.
12. Hu Y., Tan H. B., Wang X. M. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells protect against retinal ganglion cell loss in aged rats with glaucoma // Clin. Interv. Aging. – 2013. – № 8. – P. 1467-1470.
13. Levkovitch-Verbin H., Sadan O., Vander S. et al. Intravitreal Injections of Neurotrophic Factors Secreting Mesenchymal Stem Cells Are Neuroprotective in Rat Eyes following Optic Nerve Transection // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2010. – Vol. 51, № 12. – P. 6394-6400.
14. Marotte L.R., Vidovic M., Wheeler E. et al. Brainderived neurotrophic factor is expressed in a gradient in the superior colliculus during development of the retinocollicular projection // Eur. J. Neurosci. – 2004. – Vol. 20, № 3. – P. 843-847.
15. 15. Park E., Patel A.N. Changes in the expression pattern of mesenchymal and pluripotent markers in human adipose-derived stem cells // Cell. Biol. Int. – 2010. – Vol. 34. – P. 979-984.
16. Pease M.E., McKinnon S.J., Quigley H.A. et al. Obstructed axonal transport of BDNF and its receptor TrkB in experimental glaucoma // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2000. – Vol. 41. – P. 764-774.
17. Polisetty N., Fatima A., Madhira S.L. et al. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye // Mol. Vis. – 2008. – Vol. 14. – P. 431-442.
18. Quigley H.A. Neuronal death in glaucoma // Prog. Retin. Eye Res. – 1999. – Vol. 18. – P. 39-57.
19. Quigley H.A., Broman A.T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020 // Br. J. Ophthalmol. – 2006. – Vol. 90, № 3. – P. 262-267.
20. Sadan O., Bahat-Stromza M., Barhum Y. et al. Protective effects of neurotrophic factors secreting cells in a 6OHDA rat model of Parkinson disease // Stem. Cells dev. – 2009. – Vol. 18, № 8. – P. 1179-1190.
21. Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F. et al. Adult Bone Marrow Stromal Cells differentiate into Neural Cells in Vitro // Exp. Neurol. – 2000. – Vol. 164. – № 2. – P. 247-256.
22. Tolar J., Le Blanc K., Keating A., Blazar B.R. Hitting the right spot with mesenchymal stromal cells (MSCs) // Stem Cells. – 2010. – Vol. 28. – P. 1446-1455.
23. Vercelli A., Mereuta O.M., Garbossa D. et al. Human mesenchymal stem cell transplantation extends survival, improves motor performance and decreases neuroinflammation in mouse model of amyotrophic lateral sclerosis // Neurobiol. Dis. – 2008. – Vol. 31. – № 3. – P. 395-405.
24. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J., Black I.B. Adult Rat and Human Bone Marrow Stromal Cells differentiate into Neurons // Journal of Neuroscience Research. – 2000. – Vol. 61. – № 4. – P. 364-370.
Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery. 2017; : 28-36
PREOPERATIVE PREPARATION OF LIMBAL CELL TRANSPLANTS FOR THE TREATMENT OF OPTIC NEUROPATHY (EXPERIMENTAL STUDY)
https://doi.org/10.25276/0235-4160-2017-2-28-36Abstract
Purpose. To study experimentally in vitro secretion of the nerve growth factor (NGF) and the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) using intact and induced multi-potent mesenchymal limbal stem cells (MSCs) in three-dimensional culture (3D).
Material and methods. MSCs were obtained by culturing of limbal fragments, isolated from the cadaveric human donor eyes, according to the medical technology of the S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution. The phenotype of obtained cell culture was studied by the flow cytometry method.
Stimulation of secretion of neurotrophic factors was performed via a two-step technique using non-specific activation factors: EGF, hbFGF, N2 additive, dibutyryl cAMP, NRG1-beta 1, PDGF, 3-isobutyl-1- methylxanthine. The 3D-cell spheroids were generated using agarose plates (3D Petri dishes, Microtissue, USA) for three comparative groups where: Group I – control, Group II – with the induction of spheroids at 1 day of cultivation; Group III – with induction of spheroids at 7 days of cultivation. The concentration of NGF and BDNF in the culture medium was studied using the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).
Results. The induction of the 3D spheroids of limbal MSCs, that carried out on the 1st and 7th days of incubation, contributes to a significant increase in the production of NGF and BDNF, but subsequently a pronounced reduction in the secretion of these factors is observed. The conducting of an induction leads to a change in the morphology of spheroids: loss of compactness, the emergence of «fringed» (debris). Such changes indicate a non-viability of the obtained 3D-cell spheroids.
Conclusion. The cellular spheroids, created from 2D-culture of intact limbal MSCs by the three-dimensional culture method, are capable in sufficient therapeutic concentrations spontaneously to synthesize NGF and BDNF, have the most optimal design for transplantation in extrabulbar and intraocular tissue niches of the eyeball, are a potential source of prolonged secretion of neural basis function in cell treatment of optic neuropathy.
References
1. Borzenok S.A., Onishchenko N.A., Tonaeva Kh.D. i dr. Sotransplantatsiya MMSK-podobnykh kletok limba sposobstvuet mestnoi immunokorrektsii i prozrachnomu prizhivleniyu transplantata rogovitsy pri keratoplastike vysokogo riska // Vestnik transplantologii i iskusstvennykh organov. – 2014. – T. XVI, № 1. – S. 12-20.
2. Gomazkov O.A. Starenie mozga i neirotroficheskaya terapiya. – M.: IKAR, 2011. – 92 s.
3. Gorkun A.A. Izuchenie indutsirovannogo vaskulogeneza v 3D kul'ture mul'tipotentnykh mezenkhimal'nykh stromal'nykh kletok pupochnogo kanatika: Avtoref. dis. … kand. biol. nauk. – M., 2012. – 25 s.
4. Egorov E.A., Brezhnev A.Yu., Egorov A.E. Neiroprotektsiya pri glaukome: sovremennye vozmozhnosti i perspektivy // RMZh «Klinicheskaya oftal'mologiya». – 2014. – № 2. – S. 108-112.
5. Patent RF № 2475218. Sposob vydeleniya i organotipicheskogo kul'tivirovaniya allogennogo limbal'nogo transplantata / Borzenok S.A., Malyugin B.E., Tonaeva Kh.D., Onishchenko N.A., Komakh Yu.A., Kovshun E.V.; Zayavitel' i patentoobladatel' FGAU «MNTK «Mikrokhirurgiya glaza» im. akad. S.N. Fedorova» Minzdrava Rossii»; Zayavl. 06.12.2011 g.; Opubl. 20.02.2013 g. // Byul. – 2013. – № 5. – 13 s.
6. Baer P.C., Griesche N., Luttmann W. et al. Human adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro: evaluation of an optimal expansion medium preserving stemness // Cytotherapy. – 2010. – Vol. 12. – P. 96-106.
7. Baraniak P.R., McDevitt T.C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential // Cell Tissue Res. – 2012. – Vol. 347, № 3. – P. 701-711.
8. Crigler L., Robey R. C., Asawachaicharn A. et al. Human mesenchymal stem cell subpopulations express a variety of neuro-regulatory molecules and promote neuronal cell survival and neuritogenesis. // Exp. Neurol. – 2006. – 198 (1). – P. 54-64.
9. Flammer J., Haefliger I., Orgul S. Vascular dysregulation: a principal risk factor for glaucomatous damage? // J. Glaucoma. – 1999. – Vol. 8. – P. 212-219.
10. Gnecchi M., He H., Liang O.D. et al. Paracrine action accounts for marked protection of ischemic heart by Akt-modified mesenchymal stem cells // Nat. Med. – 2005. – Vol. 11, № 4. – P. 367-368.
11. Harper M.M., Grozdanic S.D., Blits B. et al. Transplantation of BDNF secreting mesenchymal stemcells provides neuroprotection in chronically hypertensiverat eyes // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2011. – Vol. 52, № 7. – P. 4506-4515.
12. Hu Y., Tan H. B., Wang X. M. et al. Bone marrow mesenchymal stem cells protect against retinal ganglion cell loss in aged rats with glaucoma // Clin. Interv. Aging. – 2013. – № 8. – P. 1467-1470.
13. Levkovitch-Verbin H., Sadan O., Vander S. et al. Intravitreal Injections of Neurotrophic Factors Secreting Mesenchymal Stem Cells Are Neuroprotective in Rat Eyes following Optic Nerve Transection // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2010. – Vol. 51, № 12. – P. 6394-6400.
14. Marotte L.R., Vidovic M., Wheeler E. et al. Brainderived neurotrophic factor is expressed in a gradient in the superior colliculus during development of the retinocollicular projection // Eur. J. Neurosci. – 2004. – Vol. 20, № 3. – P. 843-847.
15. 15. Park E., Patel A.N. Changes in the expression pattern of mesenchymal and pluripotent markers in human adipose-derived stem cells // Cell. Biol. Int. – 2010. – Vol. 34. – P. 979-984.
16. Pease M.E., McKinnon S.J., Quigley H.A. et al. Obstructed axonal transport of BDNF and its receptor TrkB in experimental glaucoma // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2000. – Vol. 41. – P. 764-774.
17. Polisetty N., Fatima A., Madhira S.L. et al. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye // Mol. Vis. – 2008. – Vol. 14. – P. 431-442.
18. Quigley H.A. Neuronal death in glaucoma // Prog. Retin. Eye Res. – 1999. – Vol. 18. – P. 39-57.
19. Quigley H.A., Broman A.T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020 // Br. J. Ophthalmol. – 2006. – Vol. 90, № 3. – P. 262-267.
20. Sadan O., Bahat-Stromza M., Barhum Y. et al. Protective effects of neurotrophic factors secreting cells in a 6OHDA rat model of Parkinson disease // Stem. Cells dev. – 2009. – Vol. 18, № 8. – P. 1179-1190.
21. Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F. et al. Adult Bone Marrow Stromal Cells differentiate into Neural Cells in Vitro // Exp. Neurol. – 2000. – Vol. 164. – № 2. – P. 247-256.
22. Tolar J., Le Blanc K., Keating A., Blazar B.R. Hitting the right spot with mesenchymal stromal cells (MSCs) // Stem Cells. – 2010. – Vol. 28. – P. 1446-1455.
23. Vercelli A., Mereuta O.M., Garbossa D. et al. Human mesenchymal stem cell transplantation extends survival, improves motor performance and decreases neuroinflammation in mouse model of amyotrophic lateral sclerosis // Neurobiol. Dis. – 2008. – Vol. 31. – № 3. – P. 395-405.
24. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J., Black I.B. Adult Rat and Human Bone Marrow Stromal Cells differentiate into Neurons // Journal of Neuroscience Research. – 2000. – Vol. 61. – № 4. – P. 364-370.
