Офтальмохирургия. 2013; : 89-97
РАЗРАБОТКА БИОИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ИСКУССТВЕННОЙ РОГОВИЦЫ НА ОСНОВЕ ПЛЕНОЧНОГО МАТРИКСА ИЗ СПИДРОИНА И КУЛЬТИВИРОВАННЫХ КЛЕТОК ЛИМБАЛЬНОЙ ЗОНЫ ГЛАЗНОГО ЯБЛОКА
https://doi.org/undefinedАннотация
Реферат
Цель. Изучить предпосылки к разработке биоинженерной конструкции искусственной роговицы на основе тканевого матрикса из рекомбинантного спидроина путем оценки поведения на его поверхности плоскостных (2D) и трехмерных (3D) клеточных культур.
Материал и методы. Изучали первичные культуры эпителиоидных и стромальных клеток (МСК-Л), полученных из лимбальной зоны аутопсированных глаз доноров. Клетки засевали на чашки Петри и в лунки 12-луночных культуральных планшетов (Corning, США). Для получения сфероидов клетки после второго пассажа центрифугировали и высевали на агарозные планшеты, затем культивировали в термостатируемой камере (Cell-IQ, Chip Man Technologies, Финляндия) в стандартных условиях (37о С, 5% СО2). Контроль роста и морфологии клеток в планшетах проводили под инвертированным микроскопом CKX41 (Olympus, Япония). Для подсчета количества клеток и их жизнеспособности использовали автоматический счетчик клеток Countess (Invitrogen, США), экспрессию поверхностных белков анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Для заселения матриксов использовали МСК-Л 3 пассажа и 7-дневные сфероиды из МСК-Л. Оценку роста 2D и 3D клеточных культур на поверхности пленочных матриксов из рекомбинантного спидроина, определение их нетоксичности и адгезивности проводили с использованием иммуногистохимических исследований, световой цейтраферной микроскопии (Cell-IQ, Chip Man Technologies, Финляндия), лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (FluoView FV10i, Olympus, Япония) и растровой электронной микроскопии (CamScan, Япония).
Результаты. После посева клеток уже через несколько часов наблюдалось активное их прикрепление к подложке. Прикрепившиеся клетки имели округлую, овальную или полигональную архитектонику. Через сутки наблюдалось появление биполярных вытянутых клеток и островков мигрирующих эпителиоидных клеток. Сфероиды в процессе инкубирования под действием силы тяжести скапливались преимущественно в центральной зоне матрикса, и уже через 2 часа отмечалась активная миграция эпителиоподобных клеток поверхностной области сфероидов по пленке. Через сутки инкубации все выселившиеся на поверхность пленочного матрикса клетки имели мезенхимоподобный фенотип. Сфероиды обладали способностью неограниченно сливаться, после чего наблюдали формирование новой микроткани с эпителиальными клетками на поверхности и мезенхимоподобными клетками в центральной области. Как одиночные сфероиды, так и полученная в результате их слияния микроткань содержали эпителиальный и мезенхимный компоненты, а также регулярно организованные фибриллы внеклеточного матрикса.
Выводы. В свете полученных данных, разработка биоинженерных клеточно-тканевых конструкций искусственной роговицы на основе технологии культивирования клеточных сфероидов (3D), получаемых из мультипотентных стволовых клеток лимба и спидроинового матрикса, представляется перспективной и требующей дальнейшей более углубленной разработки.
Список литературы
1. Агапов И.И., Пустовалова О.Л., Мойсенович М.М. и др. Трехмерный матрикс из рекомбинантного белка паутины для тканевой инженерии // Доклады Академии наук.– 2009.– Т. 426, № 1.– С. 115-118.
2. Борзенок С.А., Сабурина И.Н., Репин В.С. и др. Методологические и технологические проблемы конструирования искусственной роговицы на базе 3D-клеточного культивирования // Офтальмохирургия.– 2012.– № 4.– С. 12-17.
3. Сабурина И.Н, Горкун А.А., Кошелева Н.В. и др. Сопоставление поведения стромальных клеток пупочного канатика и мультипотентных стромальных келеток взрослого костного мозга в 2-D и 3-D культуре: моделирование стромальной регенерации // Вестник новых медицинских технологий.– 2009.– Т. 16, № 4.– С. 9-11.
4. Сабурина И.Н., Репин В.С. 3D-культивирование: от отдельных клеток к регенерационной ткани (к вопросу о феномене эпителио-мезенхимальной пластичности) // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.– 2009.– Т. 5, № 3.– С. 75-86.
5. Allmeling C., Jokuszies A., Reimers K. et al. Spider silk fibres in artificial nerve constructs promote peripheral nerve regeneration // Cell Prolif.– 2008.– Vol. 41, № 3.– P. 408-420.
6. Bogush V.G., Sokolova O.S., Davydova L.I. et al. A novel model system for design of biomaterials based on recombinant analogs of spider silk proteins // J. Neuroimmune Pharmacol.– 2009.– Vol. 4, № 1.– P. 17-27.
7. Bray L.J., George K.A., Hutmacher D.W. et al. A dual-layer silk fibroin scaffold for reconstructing the human corneal limbus // Biomaterials. – 2012. – Vol.33. – №13. – P. 3529- 3538.
8. Gellynck K., Verdonk P.C., Van Nimmen E. et al. Silkworm and spider silk scaffolds for chondrocyte support // J. Mater. Sci. Mater. Med.– 2008.– Vol. 19, № 11.– P. 3399-3409.
9. Guan L., Tian P., Ge H. et al. Chitosanfunctionalized silk fibroin 3D scaffold for keratocyte culture // J. Mol. Histol.– 2013.– Vol. 44, № 5.– P. 609-618.
10. Liu X.Y., Chen J., Zhou Q. et al. In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma // Int. J. Ophthalmol.– 2013.– Vol. 6, № 4.– P. 425-429.
11. Luo H., Lu Y., Wu T. et al. Construction of tissue-engineered cornea composed of amniotic epithelial cells and acellular porcine cornea for treating corneal alkali burn // Biomaterials.– 2013.– Vol. 34, № 28.– P. 6748-6759.
12. Michellacci Y.M. Collagens and proteoglycans of the corneal extracellular matrix // Brazilian Journal of Medical and Biological Research.– 2003.– Vol. 36, № 8.– P. 1037-1046.
13. Shadforth A.M., George K.A., Kwan A.S. et al. The cultivation of human retinal pigment epithelial cells on Bombyx mori silk fibroin // Biomaterials.– 2012.– Vol. 33, № 16.– P. 4110-4117.
14. Shimazaki J., Aiba M., Goto E. et al. Transplantation of human limbal epithelium cultivated on amniotic membrane for the treatment of severe ocular surface disorders // Ophthalmology.– 2002.– Vol. 109, № 7.– P. 1285-1290.
15. Thomas V.J., Caterson B., Kao W.W. Transplantation of human umbilical mesenchymal stem cells cures the corneal defects of Mucopolysaccharidosis VII mice // Stem Cells.– 2013. [Epub ahead of print]. DOI: 10.1002/stem.1481.
16. Zeppieri M., Salvetat M.L., Beltrami A.P. et al. Human adipose-derived stem cells for the treatment of chemically burned rat cornea: preliminary results // Curr. Eye Res.– 2013.– Vol. 38, № 4.– P. 451-463.
17. Zhu J., Zhang K., Sun Y. et al. Reconstruction of functional ocular surface by acellular porcine cornea matrix scaffold and limbal stem cells derived from human embryonic stem cells // Tissue Eng. Part A.– 2013. [Epub ahead of print]. PMID: 23675636.
Fyodorov Journal of Ophthalmic Surgery. 2013; : 89-97
DEVELOPMENT OF BIOENGINEERING DESIGN OF ARTIFICIAL CORNEA BASED ON TISSUE MATRIX MADE OF SPIDROIN AND CULTIVATED CELLS OF EYE LIMBUS ZONE
https://doi.org/undefinedAbstract
Purpose. To study prerequisites for a development of artificial cornea bioengineered design based on recombinant spidroin tissue matrix by behavior evaluation of 2D (planar) and 3D cell (threedimensional) cultures on its surface.
Material and methods. We studied epithelioid and stromal primary cell cultures (MSC-L) received from the limbal zone of post-mortem donor eyes. Cells were seeded on Petri dishes and on cavities of cultural trays (Corning, USA). To get spheroid structures the cells after the second passage underwent the centrifuge and were seeded on agarous trays then were cultivated in thermostatic chamber (Cell-IQ, Chip Man Technologies, Finland) under standard conditions (37° C, 5% CO2). Control over cell growth and morphology in trays was conducted under inverted microscope CKX41 (Olympus, Japan). To count the cell quantity and their viability the automatic cell counter Countess (Invitrogen, USA) was used, to analyze the surface proteins expression the flow cytofluorimetry was applied. For matrices colonization we used the 3rd passage MSC-L and 7-day spheroids of MSC-L origin. To evaluate 2D and 3D cell cultures growth on the surface of membranous matrices of recombinant spidroin, to estimate its non-toxicity and adhesiveness the immunohistochemistry, light time-lapse microscopy (Cell-IQ, Chip Man Technologies, Finland), laser scanning confocal microscopy (FluoView FV10i, Olympus, Japan) and raster electronic microscopy (CamScan, Japan) were incorporated.
Results. Few hours after cell seeding there was active cells’ attachment to the substrate. Attached cells were characterized by rounded, oval or polygonal ordonnance. 24 hours later bipolar elongated cells and islets of migrating epithelioid cells appearance were observed. In the incubation process under gravity force the spheroids were accumulated predominantly in the central zone of the matrix, 2 hours later an active migration of spheroids surface zone epithelioid cells was registered on the membrane. After 24 hours of incubation all seeded on the surface of membranous matrix cells possessed a mesenchyme-like phenotype. Spheroids had an ability to merge limitlessly, later we observed a new microtissue formation with epithelioid cells on the surface and mesenchyme-like cells in the central area. Both solitary spheroids and merger-derived microtissue contained epithelial and mesenchymal components as well as regularly organized fibrils of extracellular matrix.
Conclusions. According to aforementioned data the development of artificial cornea bioengineered cell-tissue constructions based on the technology of 3D cell spheroids cultivation derived from multipotent stem cells of the limbus and spidroin matrix presents a promising prospect requiring a further profound investigation.
References
1. Agapov I.I., Pustovalova O.L., Moisenovich M.M. i dr. Trekhmernyi matriks iz rekombinantnogo belka pautiny dlya tkanevoi inzhenerii // Doklady Akademii nauk.– 2009.– T. 426, № 1.– S. 115-118.
2. Borzenok S.A., Saburina I.N., Repin V.S. i dr. Metodologicheskie i tekhnologicheskie problemy konstruirovaniya iskusstvennoi rogovitsy na baze 3D-kletochnogo kul'tivirovaniya // Oftal'mokhirurgiya.– 2012.– № 4.– S. 12-17.
3. Saburina I.N, Gorkun A.A., Kosheleva N.V. i dr. Sopostavlenie povedeniya stromal'nykh kletok pupochnogo kanatika i mul'tipotentnykh stromal'nykh keletok vzroslogo kostnogo mozga v 2-D i 3-D kul'ture: modelirovanie stromal'noi regeneratsii // Vestnik novykh meditsinskikh tekhnologii.– 2009.– T. 16, № 4.– S. 9-11.
4. Saburina I.N., Repin V.S. 3D-kul'tivirovanie: ot otdel'nykh kletok k regeneratsionnoi tkani (k voprosu o fenomene epitelio-mezenkhimal'noi plastichnosti) // Kletochnaya transplantologiya i tkanevaya inzheneriya.– 2009.– T. 5, № 3.– S. 75-86.
5. Allmeling C., Jokuszies A., Reimers K. et al. Spider silk fibres in artificial nerve constructs promote peripheral nerve regeneration // Cell Prolif.– 2008.– Vol. 41, № 3.– P. 408-420.
6. Bogush V.G., Sokolova O.S., Davydova L.I. et al. A novel model system for design of biomaterials based on recombinant analogs of spider silk proteins // J. Neuroimmune Pharmacol.– 2009.– Vol. 4, № 1.– P. 17-27.
7. Bray L.J., George K.A., Hutmacher D.W. et al. A dual-layer silk fibroin scaffold for reconstructing the human corneal limbus // Biomaterials. – 2012. – Vol.33. – №13. – P. 3529- 3538.
8. Gellynck K., Verdonk P.C., Van Nimmen E. et al. Silkworm and spider silk scaffolds for chondrocyte support // J. Mater. Sci. Mater. Med.– 2008.– Vol. 19, № 11.– P. 3399-3409.
9. Guan L., Tian P., Ge H. et al. Chitosanfunctionalized silk fibroin 3D scaffold for keratocyte culture // J. Mol. Histol.– 2013.– Vol. 44, № 5.– P. 609-618.
10. Liu X.Y., Chen J., Zhou Q. et al. In vitro tissue engineering of lamellar cornea using human amniotic epithelial cells and rabbit cornea stroma // Int. J. Ophthalmol.– 2013.– Vol. 6, № 4.– P. 425-429.
11. Luo H., Lu Y., Wu T. et al. Construction of tissue-engineered cornea composed of amniotic epithelial cells and acellular porcine cornea for treating corneal alkali burn // Biomaterials.– 2013.– Vol. 34, № 28.– P. 6748-6759.
12. Michellacci Y.M. Collagens and proteoglycans of the corneal extracellular matrix // Brazilian Journal of Medical and Biological Research.– 2003.– Vol. 36, № 8.– P. 1037-1046.
13. Shadforth A.M., George K.A., Kwan A.S. et al. The cultivation of human retinal pigment epithelial cells on Bombyx mori silk fibroin // Biomaterials.– 2012.– Vol. 33, № 16.– P. 4110-4117.
14. Shimazaki J., Aiba M., Goto E. et al. Transplantation of human limbal epithelium cultivated on amniotic membrane for the treatment of severe ocular surface disorders // Ophthalmology.– 2002.– Vol. 109, № 7.– P. 1285-1290.
15. Thomas V.J., Caterson B., Kao W.W. Transplantation of human umbilical mesenchymal stem cells cures the corneal defects of Mucopolysaccharidosis VII mice // Stem Cells.– 2013. [Epub ahead of print]. DOI: 10.1002/stem.1481.
16. Zeppieri M., Salvetat M.L., Beltrami A.P. et al. Human adipose-derived stem cells for the treatment of chemically burned rat cornea: preliminary results // Curr. Eye Res.– 2013.– Vol. 38, № 4.– P. 451-463.
17. Zhu J., Zhang K., Sun Y. et al. Reconstruction of functional ocular surface by acellular porcine cornea matrix scaffold and limbal stem cells derived from human embryonic stem cells // Tissue Eng. Part A.– 2013. [Epub ahead of print]. PMID: 23675636.
