Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; : 40-46
Быстрая диагностика генитального герпеса методом петлевой изотермической амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией
https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-6-40-46Аннотация
Введение. В связи с высокой клинической значимостью герпесвирусных заболеваний актуален поиск быстрых и эффективных методов их диагностики.
Целью работы была оценка диагностической эффективности метода петлевой изотермической амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (LAMP-РВ) с красителем SYTO-82 на модели инфекции вирусов простого герпеса (ВПГ).
Материалы и методы. Исследовано 44 урогенитальных соскоба, содержащих ДНК ВПГ 1-го и 2-го типа; 43 соскоба, не содержащих ДНК ВПГ, 33 из которых содержали ДНК цитомегаловируса, вируса Эпштейна–Барр и вируса герпеса 6-го типа. Для постановки LAMP-РВ использовали ДНК-полимеразу Bst 2.0 WarmStart, краситель SYTO-82, праймеры для LAMP.
Результаты. Показана высокая эффективность использования красителя SYTO-82 для детекции ДНК ВПГ 1-го и 2-го типа в реакции LAMP-РВ. В оптимальных условиях реакция LAMP-РВ позволяла в 2–3 раза сократить время реакции по сравнению с полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ПЦР-РВ) – до 35 мин. Аналитическая чувствительность выявления ВПГ 1-го и 2-го типа в LAMP-РВ составила 103 копий ДНК/мл. Диагностическая чувствительность и специфичность LAMP-диагностики ВПГ-инфекции составили 96 и 100% соответственно.
Обсуждение. Метод LAMP-РВ обладает высокой, сопоставимой с ПЦР-РВ чувствительностью и специфичностью, при этом риск получения ложноположительных результатов минимален.
Заключение. Реакция LAMP-РВ с красителем SYTO-82 позволяет быстро, с высо- кой чувствительностью и специфичностью выявлять ДНК ВПГ в клиническом материале и может рассматриваться как перспективный метод диагностики герпесвирусных инфекций на месте лечения.
Список литературы
1. Половцева Т. В., Каражас Н.В., Калугина М.Ю., Мамедова Е.А., Финогенова Н.А., Лаврентьева И.Н. Диагностика герпесвирусной инфекции у детей раннего возраста. Детские инфекции. 2012; 11(2): 51-3.
2. Сижажева А.М., Сижажева А.Л. Лабораторная диагностика герпесвирусной инфекции методом ПЦР. Инновационная наука. 2015; (12-2): 286-9.
3. Хрянин А.А. Герпес под подушкой. Распространённость вируса простого герпеса в российской популяции: многолетний мониторинг. Status Praesens. 2013; 6(17): 69-76.
4. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., et al. Loop mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28(12): E63. Doi: https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63
5. Oscorbin I.P., Belousova E.A., Zakabunin A.I., Boyarskikh U.A., Filipenko M.L. Comparison of fluorescent intercalating dyes for quantitative loop-mediated isothermal amplification (qLAMP). Biotechniques. 2016; 61(1): 20-5. Doi: https://doi.org/10.2144/000114432
6. Namvar L., Olofsson S., Bergström T., Lindh M. Detection and typing of Herpes Simplex virus (HSV) in mucocutaneous samples by TaqMan PCR targeting a gB segment homologous for HSV types 1 and 2. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(5): 2058-64. Doi: https://doi.org/10.1128/JCM.43.5.2058-2064.2005
7. Enomoto Y., Yoshikawa T., Ihira M., Akimoto S., Miyake F., Usui C., et al. Rapid Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infection by a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(2): 951-5. Doi: https://doi.org/10.1128/JCM.43.2.951-955.2005
8. Kaneko H., Iida T., Aoki K., Ohno S., Suzutani T. Sensitive and Rapid Detection of Herpes Simplex Virus and Varicella-Zoster Virus DNA by Loop-Mediated Isothermal Amplification. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(7): 3290-6. Doi: https://doi.org/10.1128/JCM.43.7.3290-3296.2005
9. Nagamine, K., Hase T., Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol. Cell. Probes. 2002; 16(3): 223-9. Doi: https://doi.org/10.1006/mcpr.2002.0415
10. Петруша О.А., Черниченко Т.Л., Кофиади И.А., Зверев В.В., Файзулоев Е.Б. Эффективность метода петлевой изотермической амплификации с флуоресцентной детекцией в диагностике парвовирусного энтерита у плотоядных. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; 1(1): 90-5.
Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2019; : 40-46
Rapid diagnostics of genital herpes by loop-mediated isothermal amplification method with fluorescent detection
https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-6-40-46Abstract
Introduction. Due to the high clinical significance of herpesvirus diseases, the searching of fast and effective methods for their diagnosis remains relevant.
The aim of the study was to evaluate the diagnostic efficiency of the loop-mediated isothermal amplification of DNA with real-time fluorescent detection (RT-LAMP) with SYTO-82 dye on a model of herpes simplex virus (HSV) infection.
Materials and methods. A total of 44 urogenital swabs containing type 1 and type 2 HSV DNA and 43 swabs without HSV DNA, including 33 samples containing the DNA of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and herpesvirus type 6, were studied. For RT-LAMP, Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase, SYTO-82 dye, LAMP primers were used.
Results. The high efficiency of HSV DNA detection in the RT-LAMP reaction with SYTO-82 dye was shown. RT-LAMP in optimal conditions allowed to reduce reaction time for 2-3 times compared to real-time PCR (to 35 minutes). Analytical sensitivity of HSV type 1 and 2 detection in RT-LAMP was 103 copies of DNA/ml. The diagnostic sensitivity and specificity of the RT-LAMP diagnosis of HSV infection were 96% and 100%, respectively.
Discussion. RT-LAMP method has a high sensitivity and specificity comparable to RTPCR, while the risk of false positive results obtaining is minimal.
Conclusion. Thus, the reaction of RT-LAMP with SYTO-82 dye allows quickly, with high sensitivity and specificity to detect HSV DNA in clinical material and can be considered as a promising point-of-care testing method.
References
1. Polovtseva T. V., Karazhas N.V., Kalugina M.Yu., Mamedova E.A., Finogenova N.A., Lavrent'eva I.N. Diagnostika gerpesvirusnoi infektsii u detei rannego vozrasta. Detskie infektsii. 2012; 11(2): 51-3.
2. Sizhazheva A.M., Sizhazheva A.L. Laboratornaya diagnostika gerpesvirusnoi infektsii metodom PTsR. Innovatsionnaya nauka. 2015; (12-2): 286-9.
3. Khryanin A.A. Gerpes pod podushkoi. Rasprostranennost' virusa prostogo gerpesa v rossiiskoi populyatsii: mnogoletnii monitoring. Status Praesens. 2013; 6(17): 69-76.
4. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., et al. Loop mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28(12): E63. Doi: https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63
5. Oscorbin I.P., Belousova E.A., Zakabunin A.I., Boyarskikh U.A., Filipenko M.L. Comparison of fluorescent intercalating dyes for quantitative loop-mediated isothermal amplification (qLAMP). Biotechniques. 2016; 61(1): 20-5. Doi: https://doi.org/10.2144/000114432
6. Namvar L., Olofsson S., Bergström T., Lindh M. Detection and typing of Herpes Simplex virus (HSV) in mucocutaneous samples by TaqMan PCR targeting a gB segment homologous for HSV types 1 and 2. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(5): 2058-64. Doi: https://doi.org/10.1128/JCM.43.5.2058-2064.2005
7. Enomoto Y., Yoshikawa T., Ihira M., Akimoto S., Miyake F., Usui C., et al. Rapid Diagnosis of Herpes Simplex Virus Infection by a Loop-Mediated Isothermal Amplification Method. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(2): 951-5. Doi: https://doi.org/10.1128/JCM.43.2.951-955.2005
8. Kaneko H., Iida T., Aoki K., Ohno S., Suzutani T. Sensitive and Rapid Detection of Herpes Simplex Virus and Varicella-Zoster Virus DNA by Loop-Mediated Isothermal Amplification. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(7): 3290-6. Doi: https://doi.org/10.1128/JCM.43.7.3290-3296.2005
9. Nagamine, K., Hase T., Notomi T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Mol. Cell. Probes. 2002; 16(3): 223-9. Doi: https://doi.org/10.1006/mcpr.2002.0415
10. Petrusha O.A., Chernichenko T.L., Kofiadi I.A., Zverev V.V., Faizuloev E.B. Effektivnost' metoda petlevoi izotermicheskoi amplifikatsii s fluorestsentnoi detektsiei v diagnostike parvovirusnogo enterita u plotoyadnykh. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2019; 1(1): 90-5.
