Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; 1: 18-25
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОЛИ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ БЕШЕНСТВА КЛЕТОК ЛИНИИ VERO С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ
https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-3-18-25Аннотация
Цель. Экспериментальное обоснование возможности определения в культуре доли инфицированных вирусом бешенства клеток линии Vero с использованием проточной цитометрии (ПЦ) и диагностического антирабического иммуноглобулина (ДАИ), меченного ФИТЦ (ВНИИЗЖ, г. Владимир). Материалы и методы. Фиксацию и пермебиализацию клеток Vero, инфицированных вирусом бешенства «Москва 3253», проводили с помощью реагента Суtofix/Cytoperm (BD Biosciences, USA) по методу Vengatesan D. et al. (2006). и внутриклеточный антиген окрашивали ДАИ. Процент инфицированных клеток определяли с помощью ПЦ через 24, 48 и 72 ч., а также через 48 ч при инфицировании клеточных культур десятикратными разведениями вируссодержащей жидкости от 10-1 до 10-8.. Результаты. Доля инфицированных клеток возрастала в промежутке времени от 24 до 48 ч в среднем с 30 до 70%. При добавлении к клеткам вируссодержащей жидкости в разведении 10-3 методом ПЦ обнаружено 6,9 ± 0,21 % инфицированных клеток Vero (P<0,001, n=3). Заключение. ПЦ проявила себя как быстрый, чувствительный и надёжный метод определения относительного числа инфицированных вирусом бешенства клеток Vero. Препарат ДАИ обладал активностью, достаточной для его эффективного использования в автоматизированном варианте постановки МФА на базе метода ПЦ. Использование ПЦ возможно на различных этапах производства и контроля антирабических препаратов, а также перспективно с точки зрения дальнейшего совершенствования диагностики бешенства.
Список литературы
1. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.
2. ГОСТ 26075-2013 Животные. Методы лабораторной диагностики бешенства. М., Стандартинформ, 2014.
3. Генералов С.В., Абрамова Е.Г., Матвеева Ж.В., Жулидов И.М., Лобовикова О.А., Свинцов Р.А., Комиссаров А.В., Киреев М.Н., Никифоров А.К. Культуральный антиген в технологии получения антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади. Проблемы особо опасных инфекций. 2012, 4 (114): 65-68.
4. Кравцов А.Л. Совершенствование диагностики инфекционных болезней, связанное с использованием технологии импульсной проточной цитометрии. Биотехнология. 2013, 3: 8-23.
5. Сибиряк С.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях. В: Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. Челябинск, 2008.
6. Alvarez-Barrientos A., Arroyo J., Canon A.R. et al. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 2000, 13 (2): 167-195.
7. Bordignon J., Ferreira S., Caporale G. et al. Flow cytometry assay for intracellular rabies virus detection. J. Virol. Methods. 2002, 105 (1): 181-186.
8. Halfmann P., Kim J. H., Eblhara H. et al. Generation of biologically contained Ebola viruses. PNAS. 2008, 105 (4): 1129-1133.
9. Hanners N.W., Eitson J.L., Usui N. Western Zika virus in human fetal neural progenitors persists long term with partial cytopathic and limited immunogenic effects. Cell Reports. 2016, 15 (11): 2315-2374.
10. McSharry J.J. Detection and quantitation of human immunodeficiency virus-infected peripheral blood mononuclear cells by flow cytometry. J. Clin. Microbiol. 1990, 28: 724-733.
11. Rudd R. J., Trimarchi C.V. Comparison of sensitivity of BHK21 cells and murine neuroblastoma cells in the isolation of a street strain rabies virus. J. Clin. Microdiol. 1987, 25: 1456-1458.
12. Sydow F., Santiago M.A., Neves-Souza P.C. et al. Comparison of Dengue infection in human mononuclear leukocytes with mosquito C6/36 and mammalian Vero cells using flow cytometry to detect virus antigen. Memento Instituo Oswaldo Cruz. 2000, 5:483-489.
13. Steen H.B., Boye E., Starsted K. et al. Applications of flow cytometry on bacteria: Cell cycle kinetics, drug effects and antibody binding. Cytometry, 1982, 2 (4): 249-256.
14. Vengatesan D., Raj G.D., Raja A. et al. Detection of rabies virus antigen or antibody using flow cytometry. Cytometry. 2006, 70B (5): 335-343.
15. Woldeheiwet Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clin. Chem. Acta. 2005, 351: 49-63.
Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2018; 1: 18-25
DETERMINATION OF THE RABIES VIRUS-INFECTED VERO LINE CELL PORTION BY FLOW CYTOMETRY
https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-3-18-25Abstract
Aim. Experimental substantiation of possibility to determine the rabies virus-infected Vero cell line portion in culture by flow cytometry (FC) and FITC labeled diagnostic anti-rabies immunoglobulin (DAI), manufactured in Russia. Materials and methods. Fixation and permeabilization of Vero cells, infected by rabies virus strain «Moscow 3253», was carried out by means of Суtofix/Cytoperm reagent (BD Biosciences, USA) according the Vengatesan D. et al. method (2006) and then intracellular rabies antigen was stained by DAI. Percentage of infected cells was determined by FC in 24, 48 and 72 h and as well in 48 h when the cell cultures were infected with tenfold dilutions of virus-containing fluid from 10-1 to 10-8. Results. There was a significant increase in the percentage of infected cells on average from 30 to 70% in time interval from 24 to 48 h. With 1000-fold dilution of viral-containing fluid the FC method detected the 6,9±0,21% of infected cells in Vero cultures (P<0,001, n=3). Conclusion. FC has proved to be a fast, sensitive and reliable method for determining the relative number of virus- infected Vero cells in cultures. The drug DAI had a sufficient activity for its effective use in the automated version of MFA based on the FC method. The use of FC is possible at various stages of anti-rabies drug production and control, and is also promising in terms of further improving of the rabies diagnosis.
References
1. Ashmarin I.P., Vorob'ev A.A. Statisticheskie metody v mikrobiologicheskikh issledovaniyakh. L., 1962.
2. GOST 26075-2013 Zhivotnye. Metody laboratornoi diagnostiki beshenstva. M., Standartinform, 2014.
3. Generalov S.V., Abramova E.G., Matveeva Zh.V., Zhulidov I.M., Lobovikova O.A., Svintsov R.A., Komissarov A.V., Kireev M.N., Nikiforov A.K. Kul'tural'nyi antigen v tekhnologii polucheniya antirabicheskogo immunoglobulina iz syvorotki krovi loshadi. Problemy osobo opasnykh infektsii. 2012, 4 (114): 65-68.
4. Kravtsov A.L. Sovershenstvovanie diagnostiki infektsionnykh boleznei, svyazannoe s ispol'zovaniem tekhnologii impul'snoi protochnoi tsitometrii. Biotekhnologiya. 2013, 3: 8-23.
5. Sibiryak S.V., Khaidukov S.V., Zurochka A.V. Otsenka apoptoza v immunologicheskikh issledovaniyakh. V: Voprosy sovremennoi protochnoi tsitometrii. Klinicheskoe primenenie. Chelyabinsk, 2008.
6. Alvarez-Barrientos A., Arroyo J., Canon A.R. et al. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 2000, 13 (2): 167-195.
7. Bordignon J., Ferreira S., Caporale G. et al. Flow cytometry assay for intracellular rabies virus detection. J. Virol. Methods. 2002, 105 (1): 181-186.
8. Halfmann P., Kim J. H., Eblhara H. et al. Generation of biologically contained Ebola viruses. PNAS. 2008, 105 (4): 1129-1133.
9. Hanners N.W., Eitson J.L., Usui N. Western Zika virus in human fetal neural progenitors persists long term with partial cytopathic and limited immunogenic effects. Cell Reports. 2016, 15 (11): 2315-2374.
10. McSharry J.J. Detection and quantitation of human immunodeficiency virus-infected peripheral blood mononuclear cells by flow cytometry. J. Clin. Microbiol. 1990, 28: 724-733.
11. Rudd R. J., Trimarchi C.V. Comparison of sensitivity of BHK21 cells and murine neuroblastoma cells in the isolation of a street strain rabies virus. J. Clin. Microdiol. 1987, 25: 1456-1458.
12. Sydow F., Santiago M.A., Neves-Souza P.C. et al. Comparison of Dengue infection in human mononuclear leukocytes with mosquito C6/36 and mammalian Vero cells using flow cytometry to detect virus antigen. Memento Instituo Oswaldo Cruz. 2000, 5:483-489.
13. Steen H.B., Boye E., Starsted K. et al. Applications of flow cytometry on bacteria: Cell cycle kinetics, drug effects and antibody binding. Cytometry, 1982, 2 (4): 249-256.
14. Vengatesan D., Raj G.D., Raja A. et al. Detection of rabies virus antigen or antibody using flow cytometry. Cytometry. 2006, 70B (5): 335-343.
15. Woldeheiwet Z. Clinical laboratory advances in the detection of rabies virus. Clin. Chem. Acta. 2005, 351: 49-63.
