Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; 1: 90-95
ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДА ПЕТЛЕВОЙ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ АМПЛИФИКАЦИИ С ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ В ДИАГНОСТИКЕ ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА У ПЛОТОЯДНЫХ
https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-90-95Аннотация
Цель. Оценка параметров диагностической ценности метода петлевой изотермической амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (real-time LAMP, RTLAMP) на модели парвовирусов энтерита плотоядных. Материалы и методы. Образцы фекалий, крови и мазков из прямой кишки разных видов хищных животных с парвовирусным энтеритом (n=39) и здоровых животных (n=31), а также лабораторные штаммы вируса энтерита норок были проанализированы методом RT-LAMP с использованием красителей SYTO-9 и SYTO-82. В качестве референтного метода использовалась ПЦР в режиме реального времени. Результаты. Показано, что метод RT-LAMP на модели парвовирусного энтерита плотоядных обеспечивает высокие показатели аналитической чувствительности (1,5×103 копий ДНК/мл), диагностической чувствительности и специфичности (до 100% при оптимальных условиях). Краситель SYTO-82 обеспечивал более высокое отношение сигнал/фон (22,6±2,1), чем краситель SYTO-9 (6,3±1,5) (p<0,0000001). Вместе с тем, с красителем SYTO-9 на пределе чувствительности (10 копий ДНК) прирост флуоресценции в реакционной смеси наблюдался на 13 минут раньше, чем для SYTO-82 (23 и 36 минут, соответственно). Заключение. Реакция RT-LAMP является перспективным методом для быстрой и высокочувствительной диагностики инфекционных заболеваний на месте лечения, а также в условиях животноводческих хозяйств или в походно-полевых условиях.
Список литературы
1. Craw P., Balachandra W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 2012, 12(14):2469-2486.
2. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000, 28(12): E63.
3. Notomi T., Mori Y., Tomita N. et al Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. Journal of Microbiology. 2015, 53 (1):1-5.
4. Streck A.F., Rüster D., Truyen U. et al. An updated TaqMan real-time PCR for canine and feline parvoviruses. J. Virol. Meth. 2013, 193:6-8.
5. Seyrig G., Stedtfeld R., Tourlousse D. Selection of fluorescent DNA dyes for real-time LAMP with portable and simple optics. J. Microbiol. Methods. 2015, 119:223-227.
6. Oscorbin I.P., Belousova E.A., Zakabunin A.I. Comparison of fluorescent intercalating dyes for quantitative loop-mediated isothermal amplification (qLAMP). Biotechniques. 2016, 61(1):20-5.
7. Wang J., Cheng S., Yi L. et al. Detection of mink enteritis virus by loop-mediated isothermal amplification (LAMP). J. Virol. Meth. 2013, 187:401-405.
Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2019; 1: 90-95
EFFECTIVENESS OF THE LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION WITH FLUORESCENT DETECTION IN THE DIAGNOSIS OF PARVOVIRUS ENTERITIS IN CARNIVORES
https://doi.org/10.36233/0372-9311-2019-1-90-95Abstract
The aim of the study was to evaluate the diagnostic value of the method of loop-mediated isothermal amplification of DNA with real-time fluorescent detection (real-time LAMP, or RT-LAMP) on the model of carnivore parvoviruses. Materials and methods. Samples of feces, blood and swabs from the rectum of different species of predatory animals with parvovirus enteritis (n = 39) and healthy animals (n = 31), as well as laboratory strains of mink enteritis virus, were analyzed by RT-LAMP using SYTO-9 and SYTO-82 dyes. Real-time PCR was used as a reference method. Results. In our study, the LAMP method with real-time fluorescence detection (RT-LAMP) in the carnivore parvovirus enteritis model provides high analytical sensitivity (1.5×103 copies of DNA/ml), diagnostic sensitivity and specificity (up to 100% under optimal conditions). Comparison of the two intercalating dyes showed that the SYTO-82 dye provides a higher signal-to-background ratio (22.6 ± 2.1) than the SYTO-9 dye (6.3 ± 1.5) (p <0.0000001 ). At the same time, SYTO-9 dye at the sensitivity limit (10 copies of DNA) provides an increase in fluorescence in the reaction mixture 13 minutes earlier than for SYTO-82 (23 and 36 minutes, respectively). Conclusion. RT-LAMP is a promising method for rapid and highly sensitive «point-of-care» diagnosis of infectious diseases, as well as in conditions of livestock farms or in field conditions.
References
1. Craw P., Balachandra W. Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review. Lab on a Chip. 2012, 12(14):2469-2486.
2. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000, 28(12): E63.
3. Notomi T., Mori Y., Tomita N. et al Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. Journal of Microbiology. 2015, 53 (1):1-5.
4. Streck A.F., Rüster D., Truyen U. et al. An updated TaqMan real-time PCR for canine and feline parvoviruses. J. Virol. Meth. 2013, 193:6-8.
5. Seyrig G., Stedtfeld R., Tourlousse D. Selection of fluorescent DNA dyes for real-time LAMP with portable and simple optics. J. Microbiol. Methods. 2015, 119:223-227.
6. Oscorbin I.P., Belousova E.A., Zakabunin A.I. Comparison of fluorescent intercalating dyes for quantitative loop-mediated isothermal amplification (qLAMP). Biotechniques. 2016, 61(1):20-5.
7. Wang J., Cheng S., Yi L. et al. Detection of mink enteritis virus by loop-mediated isothermal amplification (LAMP). J. Virol. Meth. 2013, 187:401-405.
