ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ORF3 ВИРУСА ГЕПАТИТА Е 3 ГЕНОТИПА И ОЦЕНКА ЕГО АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ

Статья в Elpub

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2018; : 46-53

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ORF3 ВИРУСА ГЕПАТИТА Е 3 ГЕНОТИПА И ОЦЕНКА ЕГО АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ

Алаторцева Г. И., Сидоров А. В., Нестеренко Л. Н., Лухверчик Л. Н., Милованова А. В., Аммур Ю. И., Михайлов М. И., Кюрегян К. К., Жаворонок С. В., Зверев В. В.

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-5-46-53

Аннотация

Цель. Разработка рекомбинантного полипептида - аналога полноразмерного белка ORF3 вируса гепатита Е (ВГЕ) 3 генотипа. Материалы и методы. Штаммы Escherichia coli, плазмидные векторы, биологические и клинические образцы, молекулярно-биологические, биоинформационные, биохимические, биотехнологические, серологические методы. Результаты. Из фекальных экстрактов от свиней из хозяйств Белгородской обл. выделена РНК, которая использована в ОТ-ПЦР для получения фрагмента гена orf3 ВГЕ 3 генотипа. С помощью А/Т-клонирования получена рекомбинантная плазмида со вставкой фрагмента ДНК (230 п.н.), кодирующего N-концевой участок белка ORF3. Рассчитана первичная структура недостающего С-концевого участка белка. Для повышения выхода целевого продукта в клетках E.coli проведена оптимизация кодонов последовательности ДНК, кодирующей полноразмерный белок ORF3. Рассчитанный фрагмент ДНК был химически синтезирован и использован при конструировании рекомбинантной плазмиды экспрессии. Получен рекомбинантный штамм E.coli - продуцент белка ORF3 в составе слитного с в-галактозидазой полипептида. Рекомбинантный белок выделен из телец-включений биомассы штамма-продуцента и хроматографически очищен. Антигенная специфичность полученного рекомбинантного полипептида подтверждена в иммунохимических реакциях (ИФА, Вестерн-блоттинг) с образцами сывороток крови больных гепатитом Е и контрольных групп пациентов. Заключение. Разработан рекомбинантный антиген ORF3 ВГЕ 3 генотипа и показана возможность его применения в диагностических тестах.

Список литературы

1. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ. 1992. № 2043409 на изобретение «Штамм бактерий Escherichia coli, используемый для получения рекомбинантных белков».

2. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ.1992. № 2071501 на изобретение «Вектор pEL5a, предназначенный для экспрессии чужеродной ДНК».

3. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н. и.др. Получение рекомбинантного аналога гликопротеина Е вируса Varicella zoster: клонирование, экспрессия и исследование антигенных свойств. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016, 15, 1(86): 77-85.

4. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н. и др. Получение рекомбинантного белка ORF3 вируса гепатита Е 1 генотипа с применением метода оптимизации кодонов. Журн. микробиол. 2017, 6: 63-72.

5. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко Л.Н. и др. Получение рекомбинантного аналога капсидного белка вируса гепатита Е 1: клонирование, экспрессия, очистка, оценка антигенных свойств. Журн. микробиол. 2017, 6: 72-80.

6. Поляков А.Д. Особенности эпидемиологического процесса гепатита Е в Белгородской области. Научные ведомости. Сер. Медицина. Фармация, 2016, 5(226), вып. 33:79-83.

7. Практическая химия белка. Ред. Дарбре А. М., 1989.

8. Солонин С.А., Мальцева Н.С., Троценко О.Е. и др. Циркуляция вируса гепатита Е на территории Хабаровского края. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2010, 16: 31-36.

9. Altschul S., Gish W., Miller W. et al. Basic local alignment search too. J. Molecular. Biology. 1990, 215(3):403-410.

10. Fogeda M., de Ory F., Aveltyn A. et al. Differential diagnosis ofhepatitis E virus, cytomegalovirus and Epstein-Barr virus infection in patients with suspected hepatitis E. J. Clin. Virol. 2009, 45(3): 259-261.

11. Graff J., Torian U. et al. A bicistronic subgenomic mRNA encodes both the ORF2 and ORF3 proteins of hepatitis E virus. J. Virol. 2006, 80: 5919-5926.

12. Hyams C., Mabayoje D.A., Copping R. et al. Serological cross reactivity to CMV and EBV causes problems in the diagnosis of acute hepatitis E virus infection. J. Med. Virol. 2014, 86(3): 478-483.

13. Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Fields H.A. et al. Epitope mapping in proteins of hepatitis E virus. Virology. 1993, 194(1): 89-96.

14. Khudyakov Y. E., Khudyakova N.S, Jue D.L. et al. Comparative characterization of antigenic epitopes in the immunodominant region of the protein encoded by open reading frame 3 in Burmese and Mexican strains of hepatitis E virus. J. Gen. Virol. 1994, 75 (3): 641-646.

15. Koonin E.V., Gorbalenya A.E., Purdy M.A. et al. Computer-assisted assignment of functional domains in the nonstructural polyprotein of hepatitis E virus: delineation of an additional group of positive-strand RNA plant and animal viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89(17): 8259-8263.

16. Ma H., Song X., Li Z. et al. Varying abilities of recombinant polypeptides from different regions of hepatitis E virus ORF2 and ORF3 to detect anti-HEV immunoglobulin M. J. Med. Virol. 2009, 81(6): 1052-1061.

17. Obriadina A., Meng J.H., Ulanova T. et al. A new enzyme immunoassay for the detection of antibody to hepatitis E virus. J. Gastroenterol Hepatol. 2002, Suppl 3:360-364.

18. Towbin H., Staehlin T., Gordon Y. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, 76(9):4350-4359.

19. Yarbough P.O., Tam A.W., Fry K.E. et al. Hepatitis E virus: identification of type-common epitopes. J. Virol. 1991, 659(11): 5790-5797.

20. Zhou Y.H., Purcell R.H., Emerson S.U. An ELISA for putative neutralizing antibodies to hepatitis E virus detects antibodies to genotypes 1, 2, 3, and 4. Vaccine. 2004, 22(20): 2578-2585.

Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2018; : 46-53

OBTAINING THE RECOMBINANT ORF3 PROTEIN OF HEPATITIS E GENOTYPE 3 AND EVALUATION OF ITS ANTIGENIC PROPERTIES

Alatortseva G. I., Sidorov A. V., Nesterenko L. N., Luhverchik L. N., Milovanova A. V., Ammur Yu. I., Mikhailov M. I., Kyuregyan K. K., Zhavoronok S. V., Zverev V. V.

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2018-5-46-53

Abstract

Aim. Design аис1 construction of the hepatitis E virus (HEV) genotype 3 full-size ORF3 recombimnt polypeptide. Materials and methods. Escherichia coli strains, ptasmid vectors, serologiral and biological amples, molecular biological, bioinformatic, biotechnological, biochemical and serological methods.Results. RNA was isolated from pig fecal extracts collected on Belgorod farms and was used in RT-PCR to obtain the fragment of the orf3 gene of the hepatitis E virus genotype 3. Using A/T-cloning a recombinant plasmid was obtained with insertion of a DNA fragment (230 bp) encoding the N-terminal region of the ORF3 protein. The primary structure of the missing C-terminal region of the ORF3 VGE of the genotype 3 was calculated by bioinformatics methods. Codon optimization of the sequence for biosynthesis in E.coli cells was performed. For constructing the recombinant plasmid a chemically synthesized DNA fragment encoding the fulllength ORF3 protein had been used. E.coli strain producing full-size recombinant protein ORF3 fused to E.coli beta-galactosidase was developed. Recombinant protein ORF3 had been isolated from the inclusion bodies of the E.coli biomass and purified by size exclusion chromatography. Antigenic specificity of recombinant polypeptide had been confirmed in immunochemical reactions (ELISA, Western blot) with sera from patients with hepatitis E and control groups of patients. Conclusion. HEV genotype 3 ORF3 recombinant antigen had been designed, and itfs applicability in diagnostic tests had been experimentally confirmed.

References

1. Alatortsev V.E., Alatortseva G.I. Patent RF. 1992. № 2043409 na izobretenie «Shtamm bakterii Escherichia coli, ispol'zuemyi dlya polucheniya rekombinantnykh belkov».

2. Alatortsev V.E., Alatortseva G.I. Patent RF.1992. № 2071501 na izobretenie «Vektor pEL5a, prednaznachennyi dlya ekspressii chuzherodnoi DNK».

3. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N. i.dr. Poluchenie rekombinantnogo analoga glikoproteina E virusa Varicella zoster: klonirovanie, ekspressiya i issledovanie antigennykh svoistv. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika. 2016, 15, 1(86): 77-85.

4. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N. i dr. Poluchenie rekombinantnogo belka ORF3 virusa gepatita E 1 genotipa s primeneniem metoda optimizatsii kodonov. Zhurn. mikrobiol. 2017, 6: 63-72.

5. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko L.N. i dr. Poluchenie rekombinantnogo analoga kapsidnogo belka virusa gepatita E 1: klonirovanie, ekspressiya, ochistka, otsenka antigennykh svoistv. Zhurn. mikrobiol. 2017, 6: 72-80.

6. Polyakov A.D. Osobennosti epidemiologicheskogo protsessa gepatita E v Belgorodskoi oblasti. Nauchnye vedomosti. Ser. Meditsina. Farmatsiya, 2016, 5(226), vyp. 33:79-83.

7. Prakticheskaya khimiya belka. Red. Darbre A. M., 1989.