ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ORF3 ВИРУСА ГЕПАТИТА Е 1 ГЕНОТИПА С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ОПТИМИЗАЦИИ КОДОНОВ

Статья в Elpub

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; : 63-72

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ORF3 ВИРУСА ГЕПАТИТА Е 1 ГЕНОТИПА С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ОПТИМИЗАЦИИ КОДОНОВ

Алаторцева Г. И., Сидоров А. В., Нестеренко Л. Н., Лухверчик Л. Н., Жукина М. В., Амыантова И. И., Мылованова А. В., Воробьев Д. С., Аммур Ю. И., Михайлов М. И., Кюрегян К. К., Кичатова B. С., Потемкин И. А., Исаева О. В., Малинникова Е. Ю., Карлсен А. А., Блинов В. М., Нурматов З. Ш., Нурматов А. З., Касымов О. Т., Жаворонок С. В., Зверев В. В.

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-6-63-72

Аннотация

Цель. Получение рекомбинантного аналога полноразмерного белка ORF3 вируса гепатита Е (ВГЕ) 1 генотипа. Материалы и методы. Штаммы Escherichia coli, плазмидные векторы, серологический и клинический материал, иммуноферментные тест-системы. Молекулярно-биологические, биоинформационные, биотехнологические, биохимические и серологические методы. Результаты. Из препарата РНК ВГЕ 1 генотипа, выделенного от больного из Киргизии, получена рекомбинантная плазмида, содержащая ДНК копию субгеномной вирусной РНК. С использованием данной плазмиды получены штаммы E.coli - продуценты рекомбинантного антигена ORF3 ВГЕ 1 генотипа в виде слитного с Р-галактозидазой E.coli полипептида, содержащего полноразмерную копию белка ORF3. Для повышения уровня экспрессии рекомбинантного белка проведена оптимизация кодонов клонированного фрагмента кДНК. Рекомбинантный белок ORF3 выделен из телец-включений биомассы штамма-продуцента и очищен методом эксклюзионной хроматографии. Антигенная специфичность полученного полипептида подтверждена методами иммуноферментного анализа и вестерн-блоттинга со специфическими сыворотками. Заключение. Разработан рекомбинантный антиген ORF3 ВГЕ 1 генотипа и экспериментально показана возможность его применения в диагностических тестах.

Список литературы

1. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ, 1992, № 2071501 на изобретение «Вектор pEL5a, предназначенный для экспрессии чужеродной ДНК».

2. Алаторцев В.Е., Алаторцева Г.И. Патент РФ, 1992, № 2043409 на изобретение «Штамм бактерий Escherichia coli, используемый для получения рекомбинантных белков».

3. Алаторцева Г.И. Получение рекомбинантных белков, содержащих антигенные детерминанты вируса гепатита Е, и создание на их основе диагностических тест-систем: Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 2000.

4. Алаторцева Г.И., Сидоров А.В., Нестеренко J1.H. и др. Получение рекомбинантного аналога гликопротеина е вируса Varicella zoster: клонирование, экспрессия и исследование антигенных свойств. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016, 15, 1 (86): 77-85.

5. Гловер Д. Новое в клонировании ДНК. Методы. М., 1989.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984.

7. Солонин С.А., Мальцева Н.С., Троценко О.Е. и др. Циркуляция вируса гепатита Е на территории Хабаровского края. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2010, 16:31-36.

8. Claudia P., Ravasi М.Е. et al. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front. Microbiol. 2014, 5: 2-8.

9. Graff J., Torian U. et al. Abicistronic subgenomic mRNA encodes both the ORF2 and ORF3 proteins of hepatitis E virus. J. Virol. 2006, 80: 5919-5926.

10. Hyams C., Mabayoje D.A., Copping R. et al. Serological cross reactivity to CMV and EBV causes problems in the diagnosis of acute hepatitis E virus infection. J. Med. Virol. 2014, 86 (3): 478-483.

11. Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Fields H.A. et al. Epitope mapping in proteins of hepatitis E virus. Virology. 1993, 194 (1): 89-96.

12. Khudyakov Y.E., Khudyakova N.S., Jue D.L. et al. Comparative characterization of antigenic epitopes in the immunodominant region of the protein encoded by open reading frame 3 in burmese and mexican strains of hepatitis E virus. J. Gen. Virol. 1994, 75 (3): 641-646.

13. Koonin E.V., Gorbalenya A.E., Purdy M.A. et al. Computer-assisted assignment of functional domains in the nonstructural polyprotein of hepatitis E virus: delineation of an additional group of positive-strand RNA plant and animal viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89 (17): 8259-8263.

14. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEG A3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings Bioinformatics. 2004, 5: 150-163.

15. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol. 1983, 157 (1): 105-132.

16. Ma H., SongX., Li Z. et al. Varying abilities of recombinant polypeptides from different regions of hepatitis E virus ORF2 and ORF3 to detect anti-HEV immunoglobulin M. J. Med. Virol. 2009,81 (6): 1052-1061.

17. Nair V.P., Anang S., Subramani C. et al. Endoplastic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E. PLoS Pathol. 2016, 12 (4): el005521.

18. Obriadina A., Meng J.H., Ulanova T. et al. A new enzyme immunoassay for the detection of antibody to hepatitis E virus. J. Gastroenterol Hepatol. 2002, Suppl 3: 360-364.

19. Resenchuk S.М., Blinov V.M. Alignment service: creation and processing of alignments of sequences of unlimited length. Comput. Appl. Biosci. (CABIOS). 1995, 11 (1): 7-11.

20. Towbin H., Staehlin Т., Gordon Y. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979, 76 (9): 4350-4359.

21. Yarbough P.O., Tam A.W., Fry K.E. et al. Hepatitis E virus: identification of type-common epitopes. J. Virol. 1991, 65 (11): 5790-5797.

22. Yonglin Yang, Shaoli Lin, Yuchen Nan et al. A linear surface epitope in a proline-rich region of ORF3 product of genotype 1 hepatitis E virus. Viruses. 2016, Aug 18;8 (8): pii: E227.

23. Zhou Y., Zhao C., Tian Y. et al. Characteristics and functions of HEVproteins. Adv. Exp. Med. Biol. 2016,948: 17-38.

Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2017; : 63-72

DESIGN OF HEPATITIS E VIRUS GENOTYPE 1 RECOMBINANT ORF3 PROTEIN BY CODON OPTIMIZATION METHOD

Alatortseva G. I., Sidorov A. V., Nesterenko L. N., Luhverchik L. N., Zhukina M. V., Amiantova I. I., Milovanova A. V., Vorobev D. S., Ammur Yu. I., Mikhailov M. I., Kyuregyan K. K., Kichatova V. S., Potemkin I. A., Isaeva O. V., Malinnikova E. Yu., Karlsen A. A., Blinov V. M., Nurmatov Z. Sh., Nurmatov A. Z., Kasymov O. T., Zhavoronok S. V., Zverev V. V.

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-6-63-72

Abstract

Aim. The development of the hepatitis E virus (HEV) genotype 1 full-size ORF3 recombinant polypeptide. Materials and methods. Escherichia coli strains, plasmid vectors, serological and clinical samples, ELISA reagent kits, molecular biological, bioinformatic, biotechnological, biochemical and serological methods. Results. HEV genotype 1 RNA had been isolated from clinical samples collected in Kyrgyzstan. DNA copy of subgenomic virus RNA had been cloned and used for further development of E.coli strains producing full-size recombinant protein ORF3 fused to E.coli beta-galactosidase. Codons optimization method was used in aim to increase expression level of recombinant protein. Recombinant protein ORF3 had been isolated from the inclusion bodies of the E.coli biomass and purified by size exclusion chromatography. Antigenic specificity of recombinant polypeptide had been confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting with the specific sera. Conclusion. HEVgenotype 1 ORF3 recombinant antigen had been designed, and it’s applicability in diagnostic tests had been experimentally confirmed.

References

1. Alatortsev V.E., Alatortseva G.I. Patent RF, 1992, № 2071501 na izobretenie «Vektor pEL5a, prednaznachennyi dlya ekspressii chuzherodnoi DNK».

2. Alatortsev V.E., Alatortseva G.I. Patent RF, 1992, № 2043409 na izobretenie «Shtamm bakterii Escherichia coli, ispol'zuemyi dlya polucheniya rekombinantnykh belkov».

3. Alatortseva G.I. Poluchenie rekombinantnykh belkov, soderzhashchikh antigennye determinanty virusa gepatita E, i sozdanie na ikh osnove diagnosticheskikh test-sistem: Avtoref. diss. kand. biol. nauk. M., 2000.

4. Alatortseva G.I., Sidorov A.V., Nesterenko J1.H. i dr. Poluchenie rekombinantnogo analoga glikoproteina e virusa Varicella zoster: klonirovanie, ekspressiya i issledovanie antigennykh svoistv. Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika. 2016, 15, 1 (86): 77-85.

5. Glover D. Novoe v klonirovanii DNK. Metody. M., 1989.

6. Maniatis T., Frich E., Sembruk Dzh. Metody geneticheskoi inzhenerii. Molekulyarnoe klonirovanie. M., Mir, 1984.

7. Solonin S.A., Mal'tseva N.S., Trotsenko O.E. i dr. Tsirkulyatsiya virusa gepatita E na territorii Khabarovskogo kraya. Dal'nevostochnyi zhurnal infektsionnoi patologii. 2010, 16:31-36.

8. Claudia P., Ravasi M.E. et al. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front. Microbiol. 2014, 5: 2-8.