УСКОРЕННЫЙ СПОСОБ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИИ НА ОСНОВЕ ИЗОТЕРМАЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ

Статья в Elpub

Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; : 24-32

УСКОРЕННЫЙ СПОСОБ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ДИФТЕРИИ НА ОСНОВЕ ИЗОТЕРМАЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ

Борисова О. Ю., Пименова А. С., Чаплин А. В., Кафарская Л. И., Афанасьев С. С., Алешкин В. А., Алешкин А. В., Афанасьев М. С., Караулов А. В.

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-5-24-32

Аннотация

Цель. Разработка ускоренного способа генодиагностики дифтерии на основе изотермальной амплификации для выявления ДНК возбудителя. Материалы и методы. Исследование проводилось на типовых коллекционных штаммах из «ГКПМ-Оболенск», а также на 135 штаммах С. diphtheriae, выделенных в бактериологических лабораториях субъектов РФ и присланных в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Выделение штаммов проводили по МУ 4.2.698-98 и МУК 4.2.3065-13. Хромосомную ДНК выделяли стандартным методом кипячения, а также с помощью трех коммерческих наборов. Детекцию результатов амплификации осуществляли в горизонтальном электрофорезе в 1,5% агарозном геле. Результаты. Установлено, что разработанный способ генодиагностики позволяет выявлять ДНК токсигенных штаммов C.diphtheriae двух биоваров, а также ДНК нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae биовара mitis с механизмами отсутствия экспрессия гена дифтерийного токсина, обусловленными наличием делеции или мобильного генетического IS элемента в гене tox. Нетоксигенные токонесущие штаммы С. diphtheriae с механизмом отсутствия экспрессия гена дифтерийного токсина, обусловленным наличием транспозона в гене tox, идентифицируются как нетоксигенные. Оценка аналитической чувствительности в сравнительных исследованиях при использовании трех коммерческих наборов для выделения ДНК показала, что с помощью набора «Рибо-преп» чувствительность достигала 4,5x10¹ ГЭ/мл. Показана высокая специфичность разработанного способа, которая оценивалась на 18 штаммах 16 других представителей рода Corynebacterium и 20 типовых штаммах микроорганизмов, выделенных из ротоглотки или вызывающих заболевания дыхательных путей. Апробация разработанного способа проведена в модельных экспериментах на иммитантах клинических образцов путем заражения одноразовых стерильных сухих тампонов последовательными разведениями бактериальной культуры (с параллельным высевом на плотные питательные среды) и составила 10³ГЭ/мл. Заключение. Разработанный способ ускоренной генодиагностики дифтерийной инфекции обладает высокой диагностической эффективностью, специфичностью и чувствительностью, позволяет выявлять 10³ - 4,5x10 ГЭ/мл C.diphtheriae в клиническом материале с одновременной верификацией токсигенных и нетоксигенных штаммов.

Список литературы

1. Aravena-Roman М., Bowman R., O'Neill G. Polymerase chain reaction for the detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae. Pathology. 1995, 27 (1): 71-73. PMID: 7603758.

2. Efstratiou A., Engler К. H., Dawes C. S. et al. Comparison of phenotypic and genotypic methods for detection of diphtheria toxin among isolates of pathogenic Corynebacteria. J. Clin. Microbiol. 1998, 36: 3173-3177.

3. Mancini F., Monaco M., Pataracchia M. et al. Identification and molecular discrimination of toxigenic and nontoxigenic diphtheria Corynebacterium strains by combined real-time polymerase chain reaction assays. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2012, 73 (2): 111-120.

4. Mikhailovich V.M., Melnikov V.G., Mazurova I.K. et al. Application of PCR for detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae strains isolated during the Russian diphtheria epidemic, 1990 through 1994. J. Clin. Microbiol. 1995, 33 (11): 3061-3063.

5. Mothershed E.A., Cassiday P.K., Pierson K. et al. Development of a real-time fluorescence PCR assay for rapid detection of the diphtheria toxin gene. J. Clin. Microbiol. 2002, 40 (12): 4713-4719.

6. Nakao H., Popovic T. Development of a direct PCR assay for detection of the diphtheria toxin gene. J. Clin. Microbiol. 1997,35 (7): 1651-1655.

7. Notomi T, Okayama H., Masubuchi H. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Hase Nucl. Acids Research. 2000, 28 (12): 63.

8. Pallen M.J. Rapid screening for toxigenic Corynebacterium diphtheriae by the polymerase chain reaction. J. Clin. Pathol. 1991,44 (12): 1025-1026.

9. Pimenta F.R, Hirata R., Jr., Rosa A. C. et al. A multiplex PCR assay for simultaneous detection of Corynebacterium diphtheriae and differentiation between non-toxigenic and toxigenic isolates. J. Med. Microbiol. 2008, 57 (11): 1438-1439.

10. Sing A., Berger A., Schneider-BrachertW. et al. Rapid detection and molecular differentiation of toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Corvnebacterium ulcerans strains by LightCycler PCR. J. Clin. Microbiol. 2011,49 (7): 2485-2489.

11. Torres L. de F., Ribeiro D., Hirata R., Jr. et al. Multiplex polymerase chain reaction to identify and determine the toxigenicity of Corynebacterium spp. with zoonotic potential and an overview of human and animal infections. Mem. Inst. OswaldoCruz. 2013,108 (3). pii: S0074-02762013000300272.

12. Zasada A. A, Forminska K., Wolkowicz T. et al. The utility of the PCR melting profile technique for typing Corynebacterium diphtheriae isolates. Lett Appl. Microbiol. 2014, 59 (3): 292-298.

Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2017; : 24-32

AN ACCELERATED METHOD OF DIPHTHERIA GENE DIAGNOSTICS BASED ON ISOTHERMAL AMPLIFICATION TO DETECT DNA OF THE CAUSATIVE AGENT

Borisova O. Yu., Pimenova A. S., Chaplin A. V., Kafarskaya L. I., Afanasiev S. S., Aleshkin V. A., Aleshkin A. V., Afanasiev M. S., Karaulov A. V.

https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-5-24-32

Abstract

Aim. Development of an accelerated method of gene diagnostics of diphtheria based on isothermal amplification for detection of DNA of the causative agent. Materials and methods. The study was carried out in typical collection strains from GKPM-Obolensk, as well as in 135 strains of C. diphtheriae isolated from bacteriological laboratories of the regions of Russian Federation and sent to the Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology Strain isolation was carried out in accordance with Ml 4.2.698-98 and 4.2.3065-13. Chromosomal DNA was isolated by standard heating method, as well as using 3 commercial kits. Detection of the amplification results was carried out in horizontal electrophoresis in 1.5% agarose gel. Results. The developed method of gene diagnostics was established to allow detection of DNA of toxigenic C. diphtheriae strains of 2 biovars, as well as DNA of non-toxigenic tox-gene bearing strains (NTTB) of C. diphtheriae mitis biovar with mechanisms of lack of expression of diphtheria toxin gene due to the presence of deletion or mobile genetic IS element in the tox gene. Non-toxigenic tox-gene bearing C. diphtheriae strain with the mechanism of lack of diphtheria toxin gene expression due to the presence of transposon in the tox gene are identified as non-toxigenic. Evaluation of the analytical sensitivity in comparative studies using 3 commercial kits for FNA isolation has shown that sensitivity reached 4.5x 10¹ GE/ml using Ribo-prep kit. H igh specificity of the developed method is shown, it was evaluated in 18 strains of 16 other members of the Corynebacterium genus and 20 typical strains of microorganisms isolated from oropharynx or causing infections of the respiratory tract. Approbation of the developed method was carried out in model experiments in imitators of clinical samples by infection of single-use sterile dry tampons by consecutive dilutions of the bacterial cultures (with parallel seeding into dense nutrient media) and was 10³ GE/ml. Conclusion. The developed method of accelerated gene diagnostics of the diphtheria infection has a high diagnostic effectiveness, specificity and sensitivity, allows to detect 10³ - 4.5x10 GE/ml C. diphtheriae in clinical material with simultaneous verification of toxigenic and non-toxigenic strains.

References

1. Aravena-Roman M., Bowman R., O'Neill G. Polymerase chain reaction for the detection of toxigenic Corynebacterium diphtheriae. Pathology. 1995, 27 (1): 71-73. PMID: 7603758.

2. Efstratiou A., Engler K. H., Dawes C. S. et al. Comparison of phenotypic and genotypic methods for detection of diphtheria toxin among isolates of pathogenic Corynebacteria. J. Clin. Microbiol. 1998, 36: 3173-3177.

5. Mothershed E.A., Cassiday P.K., Pierson K. et al. Development of a real-time fluorescence PCR assay for rapid detection of the diphtheria toxin gene. J. Clin. Microbiol. 2002, 40 (12): 4713-4719.

6. Nakao H., Popovic T. Development of a direct PCR assay for detection of the diphtheria toxin gene. J. Clin. Microbiol. 1997,35 (7): 1651-1655.

7. Notomi T, Okayama H., Masubuchi H. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Hase Nucl. Acids Research. 2000, 28 (12): 63.

8. Pallen M.J. Rapid screening for toxigenic Corynebacterium diphtheriae by the polymerase chain reaction. J. Clin. Pathol. 1991,44 (12): 1025-1026.

12. Zasada A. A, Forminska K., Wolkowicz T. et al. The utility of the PCR melting profile technique for typing Corynebacterium diphtheriae isolates. Lett Appl. Microbiol. 2014, 59 (3): 292-298.