Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021; 98: 617-627
Методика оценки активности полифункционального белка трансферринового ряда при экспериментальном моделировании кинетики развития Staphylococcus aureus
https://doi.org/10.36233/0372-9311-209Аннотация
Введение. Лактоферрин (ЛФ) представляет собой катионный мономерный гликопротеин, вырабатываемый ацинарными клетками и железами. ЛФ присутствует в разных местах слизистой оболочки в различной концентрации. В связи с разработкой различных вариантов гигиенических и лекарственных средств для лечения воспалительных заболеваний полости рта на основе ЛФ возникла необходимость объективной оценки его антибактериальных и антибиоплёночных свойств с последующим анализом сохранения активности при различных вариантах выделения данного белка из субстрата и хранения.
Цель исследования - повышение эффективности оценки антибактериальной активности ЛФ и продолжительности её сохранения в различных биологических субстратах, содержащих действующее вещество, и отдельных опытных партиях изготовленного препарата с помощью автоматического культивирования. Материалы и методы. В рамках эксперимента использовалась техника микробиологической диагностики с использованием системы автоматического культивирования микробных популяций. Заранее подготовленную бактериальную взвесь инокулировали в питательный бульон и добавляли исследуемые образцы ЛФ с последующим культивированием и анализом возможного антибактериального воздействия трансферринового белка. Для определения чувствительности выделенных штаммов применяли собственную модификацию метода серийных разведений, разработанную на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова. В работе была использована инфраструктура Уникальной научной установки «Трансгенбанк». Результаты интерпретировали по изменению оптической плотности на длине волны λ = 850 нм. Изучение динамики роста микроорганизмов проводили в нескольких параллелях. Рост бактерий приводил к изменению параметров оптической плотности, на основании которых были построены кривые роста.
Результаты и обсуждение. По результатам экспериментального исследования кривых роста бактериальных популяций отмечены статистически достоверные различия количества жизнеспособных клеток в разные фазы кривых роста при использовании различных образцов ЛФ. Установлена более высокая активность образцов человеческого рекомбинантного ЛФ. При анализе динамики роста выявлены различия в наступлении максимума размножения и его ингибирования при воздействии различных отягощающих факторов в процессе культивирования. Бактериостатическое действие ЛФ реализуется посредством связывания ионов железа, лишая бактерии этого микроэлемента, вызывает ингибирование их развития. Наряду с этим ЛФ проявляет активность против некоторых факторов вирулентности микроорганизмов, расщепляя их по типу сериновых протеаз, и таким образом препятствует их проникновению в клетки человека.
Заключение. Использованная методика автоматического культивирования микроорганизмов в биореакторе позволяет получить воспроизводимые результаты, доступна для широкого использования и может быть рекомендована для получения объективных, сравнимых между собой, достоверных сведений о противомикробных свойствах различных образцов бактерицидного белка ЛФ, выпускаемых отечественной фарминдустрией. Исследуемый субстрат, содержащий рекомбинантный человеческий ЛФ российского производства, характеризуется высокой антибактериальной активностью, сохраняющейся, как минимум, в течение 3 лет.
Список литературы
1. Олсуфьева А.В., Васянина К.А., Зоткин Д.А., Клюева Л.А., Олсуфьев С.С., Чиж Р.С. и др. Роль органов полости рта в реализации местного иммунитета с элементами морфологии язычных желёз. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2021; 172(8): 186–92. https://doi.org/10.47056/0365-9615-2021-172-8-186-192
2. Кузнецов И.А., Потиевская В.И., Качанов И.В. Изучение железосодержащих белков (лактоферрин, ферритин) при физиологических состояниях и в лабораторной диагностике заболеваний. В кн.: Гуляев Г.Ю. Инновационное развитие: потенциал науки и современного образования. Пенза: Наука и просвещение; 2017: 156–65.
3. Кузнецов И.А., Потиевская В.И., Качанов И.В., Куралева О.О. Роль лактоферрина в биологических средах человека. Современные проблемы науки и образования. 2017; (3): 69.
4. Goldman I.L., Georgieva S.G., Gurskiy Y.G., Krasnov A.N., Deykin A.V., Popov A.N., et al. Production of human lactoferrin in animal milk. Biochem. Cell. Biol. 2012; 90(3): 513–9. https://doi.org/10.1139/o11-088
5. Akiyama Y., Oshima K., Kuhara T., Shin K., Abe F., Iwatsuki K., et al. A lactoferrin-receptor, intelectin 1, affects uptake, sub-cellular localization and release of immunochemically detectable lactoferrin by intestinal epithelial Caco-2 cells. J. Biochem. 2013; 154(5): 437–48. https://doi.org/10.1093/jb/mvt073
6. Царев В.Н., Гольдман И.Л., Садчикова Е.Р., Ипполитов Е.В., Подпорин М.С. Оценка влияния рекомбинантного лактоферрина человека на характеристики кривых роста бактериальных популяций патогенов. Национальные приоритеты России. 2016; (4): 130–3.
7. Gendreau L., Loewy Z.G. Epidemiology and etiology of denture stomatitis. J. Prosthodont. 2011; 20(4): 251–60. https://doi.org/10.1111/j.1532-849x.2011.00698.x
8. Gleiznys A., Zdanavičienė E., Žilinskas J. Candida albicans importance to denture wearers. A literature review. Stomatologija. 2015; 17(2): 54–66.
9. Балмасова И.П., Царев В.Н., Янушевич О.О., Маев И.В., Мкртумян А.М., Арутюнов С.Д. Микроэкология пародонта. Взаимосвязь локальных и системных эффектов. М.: Практическая медицина; 2021.
10. Шлепотина Н.М., Пешикова М.В., Колесников О.Л., Шишкова Ю.С. Современные представления о механизмах взаимодействия биопленки и факторов клеточного иммунитета. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020; 97(1): 83–90. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-1-83-90
11. Ипполитов Е.В., Диденко Л.В., Царёв В.Н. Особенности морфологии биоплёнки пародонта при воспалительных заболеваниях дёсен (хронический катаральный гингивит, хронический пародонтит, кандида-ассоциированный пародонтит) по данным электронной микроскопии. Клиническая лабораторная диагностика. 2015; 60(12): 59–64.
12. Царев В.Н., Николаева Е.Н., Ипполитов Е.В. Пародонтопатогенные бактерии — основной фактор возникновения и развития пародонтита. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 94(5): 101–12. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-5-101-112
13. Sharma S., Sinha M., Kaushik S., Kaur P., Singh T.P. C-lobe of lactoferrin: the whole story of the half-molecule. Biochem. Res. Int. 2013; 2013: 271641. https://doi.org/10.1155/2013/271641
14. Cornish J., Naot D. Lactoferrin as an effector molecule in the skeleton. Biometals. 2010; 23(3): 425–30. https://doi.org/10.1007/s10534-010-9320-6
15. Агарков Н.М., Ткаченко П.В., Замулин Д.О., Аксёнов В.В., Гонтарева И.С., Кича Д.И. и др. Прогнозирование развития периапикального абсцесса при хроническом периодонтите у детей по параметрам крови и клеточного иммунитета. Клиническая лабораторная диагностика. 2018; 63(1): 31–4. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-1-31-34
16. Бухарин О.В., Валышев А.В., Валышева И.В. Роль лактоферрина в противоинфекционной защите. Успехи современной биологии. 2011; 131(2): 135–44.
Journal of microbiology, epidemiology and immunobiology. 2021; 98: 617-627
Method for the estimation of antibacterial activity of the polyfunctional protein from transferrin family in the experimental model of the kinetics of Staphylococcus aureus development
https://doi.org/10.36233/0372-9311-209Abstract
Introduction. Lactoferrin is a cationic monomeric glycoprotein produced by acinar cells and glands, present in different places of the mucous membrane in different concentrations. In connection with the development of various variants of hygienic and medicinal products for the treatment of inflammatory diseases of the oral cavity based on lactoferrin, there was a need for an objective assessment of its antibacterial and antibiofilms properties, followed by an analysis of the preservation of activity in various variants of the isolation of this protein from the substrate and storage.
Aim - to improve the effectiveness of evaluating the antibacterial activity of lactoferrin and the duration of its preservation in various biological substrates containing the active substance and individual experimental batches of the manufactured drug using automatic cultivation.
Materials and methods. As part of the experiment, a microbiological diagnostic technique employing a system for the automatic cultivation of microbial populations was used. A pre-prepared bacterial suspension was inoculated into the nutrient broth and the studied lactoferrin samples were added, followed by cultivation and analysis of the possible antibacterial effects of transferrin protein. To determine the sensitivity of the isolated strains, we used our own modification of the serial dilution method developed at the Department of microbiology, virology, immunology of the A.I. Yevdokimov Moscow State University of Medicine and Dentistry. The experiment was based on the programmed automatic cultivation using the RTS-1 bioreactor. The interpretation of the results was carried out by changing the optical density at a wavelength of λ = 850 nm. The study of the growth dynamics of microorganisms was carried out in several repetitions, which was reflected in the graphs of the development of bacterial populations. The assessment of the growth control of the corresponding bacterial species was reflected in the change in the optical density values, on the basis of which the curve was built. Results and discussion. According to the results of an experimental study of the growth curves of bacterial populations, statistically significant differences in the number of viable cells in different phases of the growth curves were noted, when using different lactoferrin samples. Higher activity of human recombinant lactoferrin samples was established. An analysis of growth dynamics revealed differences in the onset of the maximum reproduction and its inhibition under the influence of various aggravating factors during cultivation. The bacteriostatic effect of lactoferrin is realized through the binding of iron ions, depriving the bacteria of this microelement, causing inhibition of their development. Along with this, lactoferrin is active against certain virulence factors of microorganisms, splitting them like serine proteases, and thus prevents their penetration into human cells.
Conclusion. The method used for automatic cultivation of microorganisms in the bioreactor used allows one to obtain reproducible results, is available for wide use, and can be recommended for obtaining objective, comparable, reliable information about the antimicrobial properties of various samples of the bactericidal protein lactoferrin produced by the domestic pharmaceutical industry. The studied substrate containing recombinant human lactoferrin of Russian production is characterized by high antibacterial activity that persists for 3 years as minimum.
References
1. Olsuf'eva A.V., Vasyanina K.A., Zotkin D.A., Klyueva L.A., Olsuf'ev S.S., Chizh R.S. i dr. Rol' organov polosti rta v realizatsii mestnogo immuniteta s elementami morfologii yazychnykh zhelez. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny. 2021; 172(8): 186–92. https://doi.org/10.47056/0365-9615-2021-172-8-186-192
2. Kuznetsov I.A., Potievskaya V.I., Kachanov I.V. Izuchenie zhelezosoderzhashchikh belkov (laktoferrin, ferritin) pri fiziologicheskikh sostoyaniyakh i v laboratornoi diagnostike zabolevanii. V kn.: Gulyaev G.Yu. Innovatsionnoe razvitie: potentsial nauki i sovremennogo obrazovaniya. Penza: Nauka i prosveshchenie; 2017: 156–65.
3. Kuznetsov I.A., Potievskaya V.I., Kachanov I.V., Kuraleva O.O. Rol' laktoferrina v biologicheskikh sredakh cheloveka. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2017; (3): 69.
4. Goldman I.L., Georgieva S.G., Gurskiy Y.G., Krasnov A.N., Deykin A.V., Popov A.N., et al. Production of human lactoferrin in animal milk. Biochem. Cell. Biol. 2012; 90(3): 513–9. https://doi.org/10.1139/o11-088
5. Akiyama Y., Oshima K., Kuhara T., Shin K., Abe F., Iwatsuki K., et al. A lactoferrin-receptor, intelectin 1, affects uptake, sub-cellular localization and release of immunochemically detectable lactoferrin by intestinal epithelial Caco-2 cells. J. Biochem. 2013; 154(5): 437–48. https://doi.org/10.1093/jb/mvt073
6. Tsarev V.N., Gol'dman I.L., Sadchikova E.R., Ippolitov E.V., Podporin M.S. Otsenka vliyaniya rekombinantnogo laktoferrina cheloveka na kharakteristiki krivykh rosta bakterial'nykh populyatsii patogenov. Natsional'nye prioritety Rossii. 2016; (4): 130–3.
7. Gendreau L., Loewy Z.G. Epidemiology and etiology of denture stomatitis. J. Prosthodont. 2011; 20(4): 251–60. https://doi.org/10.1111/j.1532-849x.2011.00698.x
8. Gleiznys A., Zdanavičienė E., Žilinskas J. Candida albicans importance to denture wearers. A literature review. Stomatologija. 2015; 17(2): 54–66.
9. Balmasova I.P., Tsarev V.N., Yanushevich O.O., Maev I.V., Mkrtumyan A.M., Arutyunov S.D. Mikroekologiya parodonta. Vzaimosvyaz' lokal'nykh i sistemnykh effektov. M.: Prakticheskaya meditsina; 2021.
10. Shlepotina N.M., Peshikova M.V., Kolesnikov O.L., Shishkova Yu.S. Sovremennye predstavleniya o mekhanizmakh vzaimodeistviya bioplenki i faktorov kletochnogo immuniteta. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2020; 97(1): 83–90. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-1-83-90
11. Ippolitov E.V., Didenko L.V., Tsarev V.N. Osobennosti morfologii bioplenki parodonta pri vospalitel'nykh zabolevaniyakh desen (khronicheskii kataral'nyi gingivit, khronicheskii parodontit, kandida-assotsiirovannyi parodontit) po dannym elektronnoi mikroskopii. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2015; 60(12): 59–64.
12. Tsarev V.N., Nikolaeva E.N., Ippolitov E.V. Parodontopatogennye bakterii — osnovnoi faktor vozniknoveniya i razvitiya parodontita. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2017; 94(5): 101–12. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2017-5-101-112
13. Sharma S., Sinha M., Kaushik S., Kaur P., Singh T.P. C-lobe of lactoferrin: the whole story of the half-molecule. Biochem. Res. Int. 2013; 2013: 271641. https://doi.org/10.1155/2013/271641
14. Cornish J., Naot D. Lactoferrin as an effector molecule in the skeleton. Biometals. 2010; 23(3): 425–30. https://doi.org/10.1007/s10534-010-9320-6
15. Agarkov N.M., Tkachenko P.V., Zamulin D.O., Aksenov V.V., Gontareva I.S., Kicha D.I. i dr. Prognozirovanie razvitiya periapikal'nogo abstsessa pri khronicheskom periodontite u detei po parametram krovi i kletochnogo immuniteta. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2018; 63(1): 31–4. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2018-63-1-31-34
16. Bukharin O.V., Valyshev A.V., Valysheva I.V. Rol' laktoferrina v protivoinfektsionnoi zashchite. Uspekhi sovremennoi biologii. 2011; 131(2): 135–44.
