Журнал МедиАль. 2020; : 18-23
Опыт использования MALDI TOF минисеквенирования для исследования бета-лактамаз типа ТЕМ штаммов K. pneumoniae, циркулирующих в педиатрических стационарах
https://doi.org/10.21145/2225-0026-2020-2-18-23Аннотация
Изучение природы антибиотикорезистентности K. pneumoniae и анализ структуры β-лактамаз расширенного спектра типа являются одним из важнейших аспектов современной клинической микробиологии и эпидемиологии. Актуальным является вопрос изучения генного контекста данных ферментов с целью поиска точечных мутаций, приводящих к формированию БЛРС.
Цель исследования: проанализировать нуклеотидные последовательности генов, кодирующих β-лактамазы типа ТЕМ штаммов K. pneumoniae на наличие SNP с использованием MALDITOF минисеквенирования.
Материалы и методы. Исследовали гены blaTEM 36 штаммов K. pneumoniae, выделенных в течение эпизодов эпидемического неблагополучия в педиатрических стационарах. Идентификацию штаммов проводили с помощью времяпролетного MALDI масс-спектрометра Autoflex. Выделение ДНК производили с использованием набора «ДНК-экспресс», детекцию генов blaTEM осуществляли методом ПЦР. Реакцию минисеквенирования для выявления SNP проводили с использованием олигонуклеотидных зондов, описанных в научной литературе. Снятие спектров осуществляли с использованием MALDITOF масс-спектрометра Autoflex и программы FlexControl в ручном режиме.
Результаты. В ходе проведенной работы было установлено, что SNP в последовательности гена blaTEM в позициях 104, 240 и 238 и приводящих к замене глутаминовой кислоты на лизин – Glu104Lys, Glu240Lys, а также глицина на серин – Gly238Ser отсутствуют у всех исследованных штаммов. У 67% штаммов обнаружена мутация, приводящая к замене аланина на треонин в позиции 237 (Ala237Thr), что приводит к изменению субстратной специфичности белка и формированию БЛРС, устойчивых к действию ингибиторов.
Выводы. У 67% штаммов обнаружены однонуклеотидные замены, приводящие к изменению субстратной специфичности фермента и формированию БЛРС. Это подтверждает необходимость мониторинга частоты значимых мутаций генов антибиотикорезистентности госпитальных штаммов с целью прогнозирования эпидемической ситуации.
Список литературы
1. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Склеенова Е.Ю. и др. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011–2012 гг. // КМАХ. 2014. Т. 16, № 4. С. 254-265.
2. Эйдельштейн М.В., Журавлев В.С., Шек Е.А. Распространенность карба-пенемаз среди нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в России // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2017. Т. 17 (1). С. 36-41.
3. Молекулярно-генетический мониторинг в системе эпидемиологического надзора за инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи: федеральные клинические рекомендации, ноябрь, 2014; Нац. ассоциация специалистов по контролю инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (НП «НАСКИ»). Нижний Новгород: Ремедиум Приволжье, 2016. 48 с.
4. Рубцова М.Ю., Уляшова М.М., Бахман Т.Т., Шмид Р.Д., Егоров А.М. Мультипараметрическое определение генов и точечных мутаций в них для идентификации бета-лактамаз // Успехи биологической химии. 2010. Т. 50. С. 303-348.
5. Ikryannikova L.N., Shitikov E.A., Zhivankova D.G., Il'ina E.N., Govorun V.M., Edelstein M.V. A MALDI TOF MS-based minisequencing method for rapid detection of TEM-type extended-spectrum beta-lactamases in clinical strains of Enterobacteriaceae // Journal of Microbiological Methods. 2008. Т. 75 (3). S. 385–391.
6. Григоренко В.Г., Рубцова М.Ю., Упоров И.В., Иштубаев И.В., Андреева И.П., Щербинин Д.С., Веселовский А.В., Егоров А.М. Бактериальные сериновые бета-лактамазы ТЕМ-типа: структура и анализ мутаций // Биомедицинская химия. 2017. Т 63 (6). С. 499-507.
7. Monavari S.H., Fateh R., Vaziri F., et al. A comparative study of various methods for detection of IL28B rs12979860 in chronic hepatitis C // Scand J Clin Lab Invest. 2017.77(4). 247-252.
8. Метод анализа точечных мутаций в онкогенах с использованием технологии масс-спектрометрического минисеквенирования: пат. 2008 140067А Рос. Федерация: МПК G01N 3/48,C12Q 1/68 / Генерозов Э.В., Захаржевская Н.Б., Костин П.А., Морошкина С.Ю. – 2008140067/13, заявл. 10.10.2008; опубл. 20.04.2010.
9. Ikryannikova L.N., Afanas'ev M.V., Akopian T.A., Il'ina E.N., Govorun V.M., Kuz'min A.V., Larionova E.E., Smirnova T.G., Chernousova L.N. Mass-spectrometry based minisequencing method for the rapid detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Journal of Microbiological Methods. 2007. Т. 70 (3). С. 395-405.
10. Хунхеева Ж.Ю., Миронова Л.В., Балахонов С.В., Афанасьев М.В. Использование MALDI-TOF минисеквенирования для детекции генетически измененных вариантов возбудителя холеры // Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т. 62 (2). С. 116-120.
11. Еременко Е.И., Воропаев В.В., Котенева Е.А., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Цыганкова О.И., Буравцева Н.П., Куличенко А.Н. Разработка метода анализа единичных нуклеотидных полиморфизмов Bacillus anthracis с использованием минисеквенирования и масс-спектрометрии // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2016. Т. 11 (4). С. 565-569.
12. Вербенко Д.А., Честков А.В. Определение генетических детерминант устойчивости Neisseria gonorrhoeae к антимикробным препаратам методом минисеквенирования // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2019. Т. 21 (S1). С. 17.
13. Костин П.А., Генерозов Э.В., Захаржевская Б.Н., Говорун В.М., Лапина Т.Л., Юрьева Е.Ю., Склянская О.А., Ивашкин В.Т., Маев И.В., Любезнова И.Ю., Голубев Н.Н., Кучерявый Ю.А. Спектр соматических мутаций в генах АРС, k-Ras и ТР53 у российских пациентов с колоректальным раком и предраковыми заболеваниями толстой кишки // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2008. Т. 18 (4). С. 53-62.
MediAl. 2020; : 18-23
Experience of using MALDI TOF minisequencing for studing TEM beta-lactamases in K. pneumoniae strains circulating in pediatric hospitals
https://doi.org/10.21145/2225-0026-2020-2-18-23Abstract
Study of the nature of K. pneumoniae antibiotic resistance and analysis of the structure of extended-spectrum β-lactamases (ESBL) are one of the most important aspects of modern clinical microbiology and epidemiology. The issue of studying the gene context of these enzymes in order to search for point mutations that lead to ESBL formation is urgent.
Research objective: to analyze and search for SNPs in nucleotide sequences of genes encoding TEM β-lactamases in K. pneumoniae strains using MALDI TOF minisequencing.
Materials and methods: blaTEM genes of 36 K. pneumoniae strains isolated during episodes of epidemic trouble in pediatric hospital settings were studied. The strains were identified using an Autoflex MALDI TOF mass spectrometer. DNA isolation was performed using a DNA-express kit, blaTEM genes were detected by PCR. The minisequencing reaction for SNP detection was performed using oligonucleotide probes described in the academic literature. The spectral data were taken using an Autoflex MALDI TOF mass spectrometer and FlexControl software in the manual mode. Results. In the course of the work it was found that SNPs in the blaTEM gene sequence at positions 104, 240 and 238 and those ones leading to the substitution of glutamic acid by lysine – Glu104Lys, Glu240Lys, as well as glycine substitution by serine – Gly238Ser were absent in all studied strains. In 67% strains, a mutation was found that led to alanine substitution by threonine at position 237 (Ala237Thr), which led to a change in the proteins substrate specificity and to formation of ESBLs resistant to inhibitors.
Conclusions. In 67% strains, single nucleotide substitutions were found, leading to a change in the enzyme substrate specificity and to formation of ESBLs. This confirms the need to monitor the frequency of significant mutations in antibiotic resistance genes in hospital strains in order to ensure epidemic forecasting.
References
1. Sukhorukova M.V., Eidel'shtein M.V., Skleenova E.Yu. i dr. Antibiotikorezistentnost' nozokomial'nykh shtammov Enterobacteriaceae v statsionarakh Rossii: rezul'taty mnogotsentrovogo epidemiologicheskogo issledovaniya MARAFON v 2011–2012 gg. // KMAKh. 2014. T. 16, № 4. S. 254-265.
2. Eidel'shtein M.V., Zhuravlev V.S., Shek E.A. Rasprostranennost' karba-penemaz sredi nozokomial'nykh shtammov Enterobacteriaceae v Rossii // Izv. Sarat. un-ta. Nov. ser. Ser. Khimiya. Biologiya. Ekologiya. 2017. T. 17 (1). S. 36-41.
3. Molekulyarno-geneticheskii monitoring v sisteme epidemiologicheskogo nadzora za infektsiyami, svyazannymi s okazaniem meditsinskoi pomoshchi: federal'nye klinicheskie rekomendatsii, noyabr', 2014; Nats. assotsiatsiya spetsialistov po kontrolyu infektsii, svyazannykh s okazaniem meditsinskoi pomoshchi (NP «NASKI»). Nizhnii Novgorod: Remedium Privolzh'e, 2016. 48 s.
4. Rubtsova M.Yu., Ulyashova M.M., Bakhman T.T., Shmid R.D., Egorov A.M. Mul'tiparametricheskoe opredelenie genov i tochechnykh mutatsii v nikh dlya identifikatsii beta-laktamaz // Uspekhi biologicheskoi khimii. 2010. T. 50. S. 303-348.
5. Ikryannikova L.N., Shitikov E.A., Zhivankova D.G., Il'ina E.N., Govorun V.M., Edelstein M.V. A MALDI TOF MS-based minisequencing method for rapid detection of TEM-type extended-spectrum beta-lactamases in clinical strains of Enterobacteriaceae // Journal of Microbiological Methods. 2008. T. 75 (3). S. 385–391.
6. Grigorenko V.G., Rubtsova M.Yu., Uporov I.V., Ishtubaev I.V., Andreeva I.P., Shcherbinin D.S., Veselovskii A.V., Egorov A.M. Bakterial'nye serinovye beta-laktamazy TEM-tipa: struktura i analiz mutatsii // Biomeditsinskaya khimiya. 2017. T 63 (6). S. 499-507.
7. Monavari S.H., Fateh R., Vaziri F., et al. A comparative study of various methods for detection of IL28B rs12979860 in chronic hepatitis C // Scand J Clin Lab Invest. 2017.77(4). 247-252.
8. Metod analiza tochechnykh mutatsii v onkogenakh s ispol'zovaniem tekhnologii mass-spektrometricheskogo minisekvenirovaniya: pat. 2008 140067A Ros. Federatsiya: MPK G01N 3/48,C12Q 1/68 / Generozov E.V., Zakharzhevskaya N.B., Kostin P.A., Moroshkina S.Yu. – 2008140067/13, zayavl. 10.10.2008; opubl. 20.04.2010.
9. Ikryannikova L.N., Afanas'ev M.V., Akopian T.A., Il'ina E.N., Govorun V.M., Kuz'min A.V., Larionova E.E., Smirnova T.G., Chernousova L.N. Mass-spectrometry based minisequencing method for the rapid detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Journal of Microbiological Methods. 2007. T. 70 (3). S. 395-405.
10. Khunkheeva Zh.Yu., Mironova L.V., Balakhonov S.V., Afanas'ev M.V. Ispol'zovanie MALDI-TOF minisekvenirovaniya dlya detektsii geneticheski izmenennykh variantov vozbuditelya kholery // Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2017. T. 62 (2). S. 116-120.
11. Eremenko E.I., Voropaev V.V., Koteneva E.A., Ryazanova A.G., Aksenova L.Yu., Tsygankova O.I., Buravtseva N.P., Kulichenko A.N. Razrabotka metoda analiza edinichnykh nukleotidnykh polimorfizmov Bacillus anthracis s ispol'zovaniem minisekvenirovaniya i mass-spektrometrii // Meditsinskii vestnik Severnogo Kavkaza. 2016. T. 11 (4). S. 565-569.
12. Verbenko D.A., Chestkov A.V. Opredelenie geneticheskikh determinant ustoichivosti Neisseria gonorrhoeae k antimikrobnym preparatam metodom minisekvenirovaniya // Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2019. T. 21 (S1). S. 17.
13. Kostin P.A., Generozov E.V., Zakharzhevskaya B.N., Govorun V.M., Lapina T.L., Yur'eva E.Yu., Sklyanskaya O.A., Ivashkin V.T., Maev I.V., Lyubeznova I.Yu., Golubev N.N., Kucheryavyi Yu.A. Spektr somaticheskikh mutatsii v genakh ARS, k-Ras i TR53 u rossiiskikh patsientov s kolorektal'nym rakom i predrakovymi zabolevaniyami tolstoi kishki // Rossiiskii zhurnal gastroenterologii, gepatologii, koloproktologii. 2008. T. 18 (4). S. 53-62.
