Инфекция и иммунитет. 2021; 11: 763-770
Получение, оценка специфической активности и подлинности рекомбинантной вакцины, предназначенной для профилактики синегнойной инфекции
https://doi.org/10.15789/2220-7619-OES-1369Аннотация
Целью исследования было получение и характеристика рекомбинантной вакцины, предназначенной для иммунопрофилактики инфекций, вызываемых Pseudomonas aeruginosa. При создании вакцины использован комплекс двух высокоиммуногенных рекомбинантных белков P. aeruginosa. Первый компонент вакцины представлял собой рекомбинантную форму белка F наружной мембраны (OprF), а второй — рекомбинантную атоксическую форму (анатоксин) экзотоксина А. Эти антигены позволили разработать вакцину, стимулирующую иммунные реакции против поверхностных структур бактерии и способствующую синтезу нейтрализующих антител против экзотоксина А, одного из наиболее опасных факторов патогенности P. aeruginosa. Рекомбинантные белки синтезировали в клетках Escherichia coli и выделяли в результате двухэтапной очистки. В случае рекомбинантного белка OprF на первом этапе получали осадок, содержащий гидрофобную фракцию белков продуцента, а в случае рекомбинантного анатоксина — тельца-включения. На втором этапе проводили аффинную хроматографию в колонках с никель-сефарозой. Очищенные рекомбинантные белки диализовали против буферного раствора, содержащего 50 mМ Tris-HCl (pH 9,0) и 0,01% Tween 20, а затем стерилизовали фильтрацией. Для исследования были получены три серии рекомбинантной вакцины синегнойной (РВС), в которой рекомбинантные антигены находились в сорбированном с гидроокисью алюминия состоянии. В этой вакцине рекомбинантный белок OprF использовали в дозе 25 мкг, а рекомбинантный анатоксин — в дозе 50 мкг. Определение полноты сорбции рекомбинантных антигенов в составе вакцины оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле, используя для нанесения препараты РВС, сконцентрированные ультрафильтрацией в спин-колонках. С целью оценки подлинности рекомбинантной вакцины разработали оригинальный метод. Для этого проводили десорбцию антигенов с последующей концентрацией препарата с помощью спинколонок. Полученные сконцентрированные десорбированные вакцинные препараты анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблоттингом, в результате чего подтвер ждено наличие специфических рекомбинантных антигенов в составе вакцины. Экспериментальные серии РВС проявляли специфическую активность (защитные свойства) в эксперименте на животных (мышах). При этом использована схема двукратной, с двухнедельным интервалом внутрибрюшинной иммунизации, через две недели после которой мышей заражали токсигенной культурой P. aeruginosa штамма PA-103. Индексы эффективности защитных свойств (ИЭ) экспериментальных серий вакцины составляли не менее трех (ИЭ: 3,0–3,3), что превышало в полтора раза эффективность использования компонентов вакцины по отдельности (ИЭ: 2,0–2,3). Таким образом, подтвержден аддитивный эффект использования комплексного препарата для защиты от инфицирования токигенными штаммами синегнойной палочки.
Список литературы
1. Благовидов Д.А., Костинов М.П., Симонова О.И., Шмитько А.Д., Буркина Н.И., Шахназарян М.К. Переносимость вакцины против P. aeruginosa у детей с муковисцидозом и врожденными пороками развития легких // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016. Т. 15, № 2 (87). С. 55–66. [Blagovidov D.A., Kostinov M.P., Simonova O.I., Shmit’ko A.D., Burkina N.I., Shahnazaryan M.K. The tolerability of the vaccine against P. aeruginosa in children with cystic fibrosis and congenital lung development. Jepidemiologija i vakcinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccinal Prevention, 2016, vol. 15, no. 2, pp. 55–66. (In Russ.)] doi: 10.31631/2073-3046-2016-15-2-55-66
2. Калошин А.А., Леонова Е.И., Солдатенкова А.В., Михайлова Н.А. Исследование протективных свойств комплекса рекомбинантного белка F наружной мембраны и рекомбинантного анатоксина Pseudomonas aeruginosa // Вестник Российской академии медицинских наук. 2016. Т. 71, № 1. С. 17–22. [Kaloshin A.A., Leonova E.I., Soldatenkova A.V., Mikhailova N.A. Assessment protective properties of the recombinant complex of the outer membrane protein F and the toxoid of Pseudomonas aeruginosa. Vestnik Rossiiskoi akademii meditsinskikh nauk = Herald of the Russian Academy of Sciences, 2016, vol. 71, no. 1, pp. 117–122. (In Russ.)] doi: 10.15690/vramn584
3. Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И., Маянский Н.А. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2015. Т. 17, № 3. С. 170–186. [Lazareva A.V., Chebotar I.V., Kryzhanovskaya O.A., Chebotar V.I., Mayanskiy N.A. Pseudomonas aeruginosa: pathogenicity, pathogenesis and diseases. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya = Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy, 2015, vol. 17, no. 3, pp. 170–186. (In Russ.)]
4. Макаренко Т.А., Станиславский Е.С. Иммунологическое изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1996. № 2. C. 7–9. [Makarenko T.A., Stanislavskiĭ E.S. An immunological study of the cell-wall proteins of Pseudomonas aeruginosa. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1996, no. 2, pp. 7–9. (In Russ.)]
5. Патент № 1481962 С Российская Федерация, МПК. A61K 35/74. Способ обезвреживания очищенного экзотоксина А синегнойной палочки; заявлено 1987.07.15: опубликовано 1995.09.06 / Михайлова Н.А., Шаймухаметов Ф.А., Кузнецова Т.Н., Мороз А.Ф. Патентообладатель: УфНИИВС им. И.И. Мечникова, ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. 3 с. [Patent No. 1481962 С Russian Federation, Int. Cl. A61K 35/74. Method for rendering harmless exonoxin A of Pseudomonas aeruginosa; application: 1987.07.15: date of publication 1995.09.06 / Mikhailova N.A., Shajmukhametov F.A., Kuznetsova T.N., Moroz A.F. Proprietors: Ufimskij nauchnoissledovatel’skij institut vakcin i syvorotok im. I.I.Mechnikova (UfNIIVS im. I.I. Mechnikova), Nauchno-issledovatel’skij institut jepidemiologii i mikrobiologii im. N.F. Gamalei (GU NIIEM im. N.F. Gamalei). 3 p.]
6. Подгорная Л.Г., Дзюбан Н.Ф. Антигенные свойства анатоксина синегнойной палочки и протективное действие антитоксической противосинегнойной сыворотки // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1986. № 6. С. 67–69. [Podgornaia L.G., Dziuban N.F. Antigenic properties of Pseudomonas aeruginosa anatoxin and the protective action of antitoxic anti-Pseudomonas aeruginosa serum. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1986, no. 6, pp. 67–69. (In Russ.)]
7. Станиславский Е.С., Йоо И., Северцева М.К., Машилова Г.М., Болтуцкий Л.Г. Иммунологическая эффективность и безвредность в эксперименте пиоиммуногена-вакцины против инфекции Pseudomonas aeruginosa // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1982. № 5. С. 70–75. [Stanislavskiĭ E.S., Joó I., Severtsova M.K., Mashilova G.M., Boltutsiĭ L.G. Experimental immunological effectiveness and safety of pyoimmunogen vaccine against Pseudomonas aeruginosa infection. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1982, no. 5, pp. 70–75. (In Russ.)]
8. Титова Т.И., Сидорова Т.Н., Радкевич С.А., Анциферова Н.Г., Мороз А.Ф. Получение и изучение свойств поливалентной корпускулярной синегнойной вакцины // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1985. № 8. С. 80–88. [Titova T.I., Sidorova T.N., Radkevich S.A., Antsiferova N.G., Moroz A.F. Production and study of the properties of a polyvalent corpuscular Pseudomonas aeruginosa vaccine. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1985, no. 8, pp. 80–88. (In Russ.)]
9. Фармакопея.рф: сайт о регистрации лекарственных средств в России. Общая фармакопейная статья ОФС.1.2.4.0003.15 Стерильность. [Pharmacopoeia.ru: site about registration of drugs in Russia and EAEU (CIS). General pharmacopoeia monograph GPM.1.2.4.0003.15 Sterility]. URL: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-4-0003-15-sterilnost-3 (10.12.2019)
10. Chatterjee M., Anju C.P., Biswas L., Mohan G., Biswas R. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options. Int. J. Med. Microbiol., 2016, vol. no. 1, pp. 48–58. doi: 10.1016/j.ijmm.2015.11.004
11. Döring G., Pier G.B. Vaccines and immunotherapy against Pseudomonas aeruginosa. Vaccine, 2008, vol. 26, no. 8, pp. 1011– 1024. doi: 10.1016/j.vaccine.2007.12.007
12. Kaloshin A.A., Gatypova E.V., Mikhailova N.A. Obtaining recombinant forms of the outer membrane protein F of Pseudomonas aeruginosa and assessment of their immunogenic properties. Appl. Biochem. Microbiol., 2011, vol. 47, no. 8, pp. 780–788. doi: 10.1134/S0003683811080060
13. Kaloshin A.A., Isakov M.A., Mihailova N.A., Vertiev Ju.V. Preparation of recombinant atoxic form of exotoxin a from Pseudomonas aeruginosa. Bull. Exper. Biol. Med., 2013, vol. 154, no. 3, pp. 346–350. doi: 10.1007/s10517-013-1947-1
14. Lee N.G., Jung S.B., Ahn B.Y., Kim Y.H., Kim J.J., Kim D.K., Kim I.S., Yoon S.M., Nam S.W., Kim H.S., Park W.J. Immunization of burn-patients with a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine elicits antibodies with protective efficacy. Vaccine, 2000, vol. 18, no. 18, pp. 1952–1961. doi: 10.1016/S0264-410X(99)00479-X
15. Sambrook J.F., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. 2100 p.
16. Shanmugham R., Thirumeni N., Rao V.S., Pitta V., Kasthuri S., Singanallur N.B., Lingala R., Mangamoori L.N., Villuppanoor S.A. Immunocapture enzyme-linked immunosorbent assay for assessment of in vitro potency of recombinant hepatitis B vaccines. Clin. Vaccine Immunol., 2010, vol. 17, no. 8, pp. 1252–1260. doi: 10.1128/CVI.00192-10
Russian Journal of Infection and Immunity. 2021; 11: 763-770
Generation and evaluation of specific activity and authenticity of recombinant vaccine designed preventing against Pseudomonas aeruginosa
https://doi.org/10.15789/2220-7619-OES-1369Abstract
The aim of the study was to obtain and characterize a recombinant vaccine for the immunoprophylaxis of infections caused by Pseudomonas aeruginosa. A set of two highly immunogenic P. aeruginosa recombinant proteins was used to create related vaccine. The first vaccine component was presented by recombinant outer membrane protein F (OprF), whereas the second one — by recombinant atoxic exotoxin A (toxoid). These antigens allowed to develop vaccine inducing immune response against the surface bacterial cues and promote production of neutralizing antibodies against exotoxin A, one of the most dangerous P. aeruginosa pathogenicity factors. Recombinant proteins were synthesized in Escherichia coli cells and isolated by two-step purification. In case of recombinant OprF protein, it was initially (stage 1) isolated as a precipitate containing hydrophobic fraction of producer cell-derived proteins, whereas for recombinant toxoid we purified inclusion bodies. At stage 2, a Ni Sepharose column affinity chromatography was performed. Next, purified recombinant proteins were dialyzed against buffer solution containing 50 mМ Tris-HCl (pH 9.0) and 0.01% Tween 20 followed by filtration sterilization. Three lots of the Pseudomonas Recombinant Vaccine (PRV) were obtained for the study, wherein the recombinant antigens were absorbed with aluminum hydroxide. Recombinant OprF and toxoid protein in vaccine formula were used at a dose of 25 μg and 50 μg, respectively. Absorption completeness of the recombinant antigens within the vaccine was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis with PRV preparations concentrated by ultrafiltration in spin columns. Authenticity of recombinant vaccine was assessed by using customized method by desorbing antigens followed by ultrafiltration concentration in spin columns. Final concentrated desorbed vaccine preparations were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting, which allowed to confirm presence of specific recombinant antigens in the vaccine. The experimental PRV series demonstrated specific activity (protective properties) after inoculation in animals (mice) by using a dual vaccination protocol, wherein mice were immunized intraperitonially twice with a two-week interval. Next, two weeks later mice were infected by toxigenic P. aeruginosa strain PA-103 culture cells. The index of protective efficiency (IE) for experimental vaccine series was at least a value of three (IE: 3.0–3.3) that was by 1.5-fold higher than that for using single vaccine components (IE: 2.0–2.3). Thus, we confirmed an additive effect of using a set preparation to protect against infection caused by toxigenic Pseudomonas aeruginosa strains.
References
1. Blagovidov D.A., Kostinov M.P., Simonova O.I., Shmit'ko A.D., Burkina N.I., Shakhnazaryan M.K. Perenosimost' vaktsiny protiv P. aeruginosa u detei s mukovistsidozom i vrozhdennymi porokami razvitiya legkikh // Epidemiologiya i vaktsinoprofilaktika. 2016. T. 15, № 2 (87). S. 55–66. [Blagovidov D.A., Kostinov M.P., Simonova O.I., Shmit’ko A.D., Burkina N.I., Shahnazaryan M.K. The tolerability of the vaccine against P. aeruginosa in children with cystic fibrosis and congenital lung development. Jepidemiologija i vakcinoprofilaktika = Epidemiology and Vaccinal Prevention, 2016, vol. 15, no. 2, pp. 55–66. (In Russ.)] doi: 10.31631/2073-3046-2016-15-2-55-66
2. Kaloshin A.A., Leonova E.I., Soldatenkova A.V., Mikhailova N.A. Issledovanie protektivnykh svoistv kompleksa rekombinantnogo belka F naruzhnoi membrany i rekombinantnogo anatoksina Pseudomonas aeruginosa // Vestnik Rossiiskoi akademii meditsinskikh nauk. 2016. T. 71, № 1. S. 17–22. [Kaloshin A.A., Leonova E.I., Soldatenkova A.V., Mikhailova N.A. Assessment protective properties of the recombinant complex of the outer membrane protein F and the toxoid of Pseudomonas aeruginosa. Vestnik Rossiiskoi akademii meditsinskikh nauk = Herald of the Russian Academy of Sciences, 2016, vol. 71, no. 1, pp. 117–122. (In Russ.)] doi: 10.15690/vramn584
3. Lazareva A.V., Chebotar' I.V., Kryzhanovskaya O.A., Chebotar' V.I., Mayanskii N.A. Pseudomonas aeruginosa: patogennost', patogenez i patologiya // Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2015. T. 17, № 3. S. 170–186. [Lazareva A.V., Chebotar I.V., Kryzhanovskaya O.A., Chebotar V.I., Mayanskiy N.A. Pseudomonas aeruginosa: pathogenicity, pathogenesis and diseases. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya = Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy, 2015, vol. 17, no. 3, pp. 170–186. (In Russ.)]
4. Makarenko T.A., Stanislavskii E.S. Immunologicheskoe izuchenie belkov kletochnoi stenki Pseudomonas aeruginosa // Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 1996. № 2. C. 7–9. [Makarenko T.A., Stanislavskiĭ E.S. An immunological study of the cell-wall proteins of Pseudomonas aeruginosa. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1996, no. 2, pp. 7–9. (In Russ.)]
5. Patent № 1481962 S Rossiiskaya Federatsiya, MPK. A61K 35/74. Sposob obezvrezhivaniya ochishchennogo ekzotoksina A sinegnoinoi palochki; zayavleno 1987.07.15: opublikovano 1995.09.06 / Mikhailova N.A., Shaimukhametov F.A., Kuznetsova T.N., Moroz A.F. Patentoobladatel': UfNIIVS im. I.I. Mechnikova, GU NIIEM im. N.F. Gamalei. 3 s. [Patent No. 1481962 S Russian Federation, Int. Cl. A61K 35/74. Method for rendering harmless exonoxin A of Pseudomonas aeruginosa; application: 1987.07.15: date of publication 1995.09.06 / Mikhailova N.A., Shajmukhametov F.A., Kuznetsova T.N., Moroz A.F. Proprietors: Ufimskij nauchnoissledovatel’skij institut vakcin i syvorotok im. I.I.Mechnikova (UfNIIVS im. I.I. Mechnikova), Nauchno-issledovatel’skij institut jepidemiologii i mikrobiologii im. N.F. Gamalei (GU NIIEM im. N.F. Gamalei). 3 p.]
6. Podgornaya L.G., Dzyuban N.F. Antigennye svoistva anatoksina sinegnoinoi palochki i protektivnoe deistvie antitoksicheskoi protivosinegnoinoi syvorotki // Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 1986. № 6. S. 67–69. [Podgornaia L.G., Dziuban N.F. Antigenic properties of Pseudomonas aeruginosa anatoxin and the protective action of antitoxic anti-Pseudomonas aeruginosa serum. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1986, no. 6, pp. 67–69. (In Russ.)]
7. Stanislavskii E.S., Ioo I., Severtseva M.K., Mashilova G.M., Boltutskii L.G. Immunologicheskaya effektivnost' i bezvrednost' v eksperimente pioimmunogena-vaktsiny protiv infektsii Pseudomonas aeruginosa // Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 1982. № 5. S. 70–75. [Stanislavskiĭ E.S., Joó I., Severtsova M.K., Mashilova G.M., Boltutsiĭ L.G. Experimental immunological effectiveness and safety of pyoimmunogen vaccine against Pseudomonas aeruginosa infection. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1982, no. 5, pp. 70–75. (In Russ.)]
8. Titova T.I., Sidorova T.N., Radkevich S.A., Antsiferova N.G., Moroz A.F. Poluchenie i izuchenie svoistv polivalentnoi korpuskulyarnoi sinegnoinoi vaktsiny // Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 1985. № 8. S. 80–88. [Titova T.I., Sidorova T.N., Radkevich S.A., Antsiferova N.G., Moroz A.F. Production and study of the properties of a polyvalent corpuscular Pseudomonas aeruginosa vaccine. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 1985, no. 8, pp. 80–88. (In Russ.)]
9. Farmakopeya.rf: sait o registratsii lekarstvennykh sredstv v Rossii. Obshchaya farmakopeinaya stat'ya OFS.1.2.4.0003.15 Steril'nost'. [Pharmacopoeia.ru: site about registration of drugs in Russia and EAEU (CIS). General pharmacopoeia monograph GPM.1.2.4.0003.15 Sterility]. URL: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1-2-4-0003-15-sterilnost-3 (10.12.2019)
10. Chatterjee M., Anju C.P., Biswas L., Mohan G., Biswas R. Antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa and alternative therapeutic options. Int. J. Med. Microbiol., 2016, vol. no. 1, pp. 48–58. doi: 10.1016/j.ijmm.2015.11.004
11. Döring G., Pier G.B. Vaccines and immunotherapy against Pseudomonas aeruginosa. Vaccine, 2008, vol. 26, no. 8, pp. 1011– 1024. doi: 10.1016/j.vaccine.2007.12.007
12. Kaloshin A.A., Gatypova E.V., Mikhailova N.A. Obtaining recombinant forms of the outer membrane protein F of Pseudomonas aeruginosa and assessment of their immunogenic properties. Appl. Biochem. Microbiol., 2011, vol. 47, no. 8, pp. 780–788. doi: 10.1134/S0003683811080060
13. Kaloshin A.A., Isakov M.A., Mihailova N.A., Vertiev Ju.V. Preparation of recombinant atoxic form of exotoxin a from Pseudomonas aeruginosa. Bull. Exper. Biol. Med., 2013, vol. 154, no. 3, pp. 346–350. doi: 10.1007/s10517-013-1947-1
14. Lee N.G., Jung S.B., Ahn B.Y., Kim Y.H., Kim J.J., Kim D.K., Kim I.S., Yoon S.M., Nam S.W., Kim H.S., Park W.J. Immunization of burn-patients with a Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein vaccine elicits antibodies with protective efficacy. Vaccine, 2000, vol. 18, no. 18, pp. 1952–1961. doi: 10.1016/S0264-410X(99)00479-X
15. Sambrook J.F., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. 2100 p.
16. Shanmugham R., Thirumeni N., Rao V.S., Pitta V., Kasthuri S., Singanallur N.B., Lingala R., Mangamoori L.N., Villuppanoor S.A. Immunocapture enzyme-linked immunosorbent assay for assessment of in vitro potency of recombinant hepatitis B vaccines. Clin. Vaccine Immunol., 2010, vol. 17, no. 8, pp. 1252–1260. doi: 10.1128/CVI.00192-10
