Андрология и генитальная хирургия. 2020; 21: 76-88
Исследование клеток Сертоли и сперматогенных клеток крыс при экспериментально индуцированном метаболическом синдроме и проведении бальнеофизиотерапии
https://doi.org/10.17650/2070-9781-2020-21-4-76-88Аннотация
Введение. Метаболический синдром (МС) может быть причиной нарушения сперматогенеза и ухудшения параметров спермограммы. Однако механизмы влияния МС на формирующиеся сперматогенные клетки остаются неясными. Сложность этой актуальной проблемы андрологии и репродуктологии и противоречивость опубликованных данных свидетельствуют о целесообразности использования экспериментальных моделей МС для ее решения.
Цель исследования – изучение особенностей течения профазы I мейоза и активности процессов фагоцитоза и аутофагии в клетках Сертоли крыс с экспериментально вызванным МС и при проведении лечебно-профилактических процедур во время развития экспериментального МС.
Материалы и методы. Эксперимент проведен на 12 половозрелых самцах крыс. Животные были разделены на 3 равные группы: 1-я группа – самцы, рацион питания которых был стандартным; 2-я группа – самцы, рацион которых в течение 60 сут характеризовался высоким содержанием жира и фруктозы; 3-я группа – самцы, получавшие сульфатные минеральные воды и подвергавшиеся воздействию низкоинтенсивного электромагнитного излучения сверхвысокой частоты. Клетки семенников исследовали с помощью световой и трансмиссионной электронной микроскопии. Впервые у животных с МС проведено иммуноцитохимическое исследование особенностей синапсиса хромосом в профазе I мейоза на основе анализа распластанных синаптонемных комплексов мейотических хромосом и иммуноцитохимического анализа клеток Сертоли и клеток сперматогенного ряда в препаратах давленых клеток семенных канальцев. Для статистической обработки данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента и непараметрический U-критерий Манна–Уитни.
Результаты. В результате гистологического исследования структуры семенных канальцев животных 3 групп выявлено статистически значимое снижение индекса сперматогенеза во 2-й и 3-й группах по сравнению с контролем. Иммуноморфологически в распластанных ядрах первичных сперматоцитов крыс 2-й и 3-й групп обнаружены нарушения архитектоники ядер, формирование фрагментов синаптонемных комплексов, а также многочисленных включений, окрашивающихся антителами к белку SCP3. Признаки пахитенного ареста выявлены в 40–50 % ядер сперматоцитов у крыс 2-й группы. При исследовании препаратов давленых клеток семенных канальцев крыс 2-й и 3-й групп в цитоплазме клеток Сертоли обнаружены следы фагоцитированных синаптонемных комплексов, что доказано с помощью окрашивания антителами к белку SCP3. Таким образом, получены доказательства фагоцитоза дегенерирующих первичных сперматоцитов клетками Сертоли. В клетках Сертоли, сперматоцитах и сперматидах обнаружено множество аутофагосом, маркером которых является белок LC3B. Наличие аутофагосом в клетках Сертоли и клетках сперматогенного ряда у животных этих 2 групп подтверждено и при электронной микроскопии. У самцов крыс 2-й группы выявлены значительные нарушения в структуре пахитенных ядер. В цитоплазме клеток Сертоли и сперматидах крыс 2-й группы выявлены липидные капли, многочисленные фаголизосомы, содержащие клеточный детрит. Обнаружено повреждение структуры и фагоцитоз митохондрий в клетках Сертоли и сперматоцитах. Ауто фагия в клетках Сертоли и клетках сперматогенного ряда была наиболее ярко выражена у животных 3-й группы.
Заключение. У самцов крыс с экспериментальным МС выявлены значительные нарушения в структуре ядер мейотических клеток, высокое содержание первичных сперматоцитов с признаками пахитенного ареста. Полученные результаты согласуются с данные других авторов, сообщивших о снижении количества сперматозоидов в эпидидимисах крыс и мышей при моделировании МС. Предполагается, что активация аутофагии является важным фактором поддержки жизнеспособности клеток Сертоли и половых клеток в стрессовых ситуациях, в том числе при МС. По-видимому, аутофагия выступает как адаптивный механизм, обеспечивающий удаление остатков апоптических сперматогенных клеток, подвергшихся селекции в результате развития МС.
Список литературы
1. Gómez-Elías M.D., Rainero Cáceres T.S., Giaccagli M.M. et al. Association between high-fat diet feeding and male fertility in high reproductive performance mice. Sci Rep 2019;9(1):18546. DOI: 10.1038/s41598-019-54799-3.
2. Carlsen E., Giwercman A., Keiding N., Skakkeback N.E. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. Br Med J 1992;305:609–13. DOI: 10.1136/bmj.305.6854.609.
3. Foresta C., Moro E., Ferlin A. Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis. Endocrine Reviews 2001;22(2):226–39. DOI: 10.1210/edrv.22.2.0425.
4. Епанчинцева Е.А., Селятицкая В.Г., Свиридова М.А., Лутов Ю.В. Медико-социальные факторы риска бесплодия у мужчин. Андрология и генитальная хирургия 2016;17(3):47–53. DOI: 10.17650/2070-9781-2016-17-3-47-53. DOI: 10.17650/2070-9781-2016-17-3-47-53.
5. Campbell J.M., Lane M., Owens J.A., Bakos H.W. Paternal obesity negatively affects male fertility and assisted reproduction outcomes: a systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online 2015;31(5):593–604. DOI: 10.1016/j.rbmo.2015.07.012.
6. Belloc S., Cohen-Bacrie M., Amar E. et al. High body mass index has a deleterious effect on semen parameters except morphology: results from a large cohort study. Fertil Steril 2014;102(5):1268–73. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2014.07.1212.
7. Davidson L.M., Millar K., Jones C. et al. Deleterious effects of obesity upon the hormonal and molecular mechanisms control ling spermatogenesis and male fertility. Hum Fertil (Camb) 2015;18(3):184–93. DOI: 10.3109/14647273.2015.1070438.
8. MacDonald A.A., Herbison G.P., Showell M., Farquhar C.M. The impact of body mass index on semen parameters and reproductive hormones in human males: a systematic review with meta-analysis. Hum Reprod 2010;16(3):293–311. DOI: 10.1093/humupd/dmp047.
9. Vigueras-Villaseñor R.M., Rojas-Castañeda J.C., Chávez-Saldaña M. et al. Alterations in the spermatic function generated by obesity in rats. Acta Histochem 2011;113(2):214–20. DOI: 10.1016/j.acthis.2009.10.004.
10. Turner J.M.A., Mahadevaiah S.K., Fernandez-Capetillo O. et al. Silencing of unsynased meiotic chromosomes in the mouse. Genetics 2005;37(1):41–7. DOI: 10.1038/ng1484.
11. Kolomiets O.L., Atsaeva M.M., Dadashev S.Ya. et al. Damage to synaptonemal complex structure and peculiarities of selection of mouse spermatocytes I at response to drug administration. Russian Journal of Genetics 2013;49(11):1098–106. DOI: 10.1134/S1022795413110100.
12. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л. Синаптонемный комплекс – индикатор мейоза и изменчивости хромосом. М., 2007. 358 с. [Bogdanov Yu.F., Kolomiets O.L. Synaptonemal complex as indicator of chromosome variability. Moscow, 2007. 358 p. (In Russ.)].
13. Королев Ю.Н., Никулина Л.А., Гениатулина М.С. и др. Профилактика ранних постстрессорных нарушений в семенниках крыс при применении питьевой сульфатной минеральной воды в сочетании с цинком и кремнием. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2011;(5):33–5.
14. Королев Ю.Н., Курило Л.Ф., Гениатулина М.С. и др. Пострадиационные нарушения в семенниках крыс и их профилактика при применении питьевой сульфатной минеральной воды. Проблемы репродукции 2003;9(6):16–9.
15. Королев Ю.Н., Гениатулина М.С., Никулина Л.А., Михайлик Л.В. Ультраструктурные проявления регенеративных процессов в клетках Сертоли при действии низкоинтенсивного электромагнитного излучения в условиях стресса у крыс. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2015;92(3): 40–4.
16. Королев Ю.Н., Никудина Л.А., Михайлик Л.В. Метаболические и ультраструктурные механизмы адаптации при первично-профилактическом действии низкоинтенсивного электромагнитного излучения в условиях нормы и радиации. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2019;(5):44–50.
17. Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф. Морфометрические методы в оценке функционального состояния семенников. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии 1983;84(3):66–72.
18. Navarro J., Vidal F., Guitart M., Egozcue J. A method for the sequential study of synaptonemal complexes by light and electron microscopy. Hum Genet 1981;59(4): 419–21. DOI: 10.1007/BF00295483.
19. Kolomiets O.L., Matveevsky S.N., Bakloushinskaya I.Y. Sexual dimorphism in prophase I of meiosis in the Northern mole vole (Ellobius talpinus Pallas, 1770) with isomorphic (XX) chromosomes in males and females. Comp Cytogenet 2010;4(1):55–66. DOI: 10.3897/compcytogen.v4i1.25.
20. Page J., Suja J.A., Santos J.L., Rufas J.S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res 1998;6(8):639–42. DOI: 10.1023/a:1009209628300.
21. Moens P.B., Earnshaw W.C. Anti-topoiso-merase II recognizes meiotic chromosome cores. Chromosoma 1989;98(5):317–22. DOI: 10.1007/BF00292383.
22. Kerr J.B. Ultrastructure of the seminiferous epithelium and intertubular tissue of the human testis. J Electron Microsc Tech 1991;19(2):215–40. DOI: 10.1002/jemt.1060190208.
23. Kroemer G., Marino G., Levine B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell 2010;40(2):280–93. DOI: 10.1016/j.molcel.2010.09.023
24. Eid N., Ito Y., Horibe A., Hamaoka H., Kondo Y.A. Method for in vivo induction and ultrastructural detection of mitophagy in Sertoli cells. Methods Mol Biol 2018;1748: 103–12. DOI: 10.1007/978-1-4939-7698-0_9.
25. Oliveira P.F., Martins A.D., Moreira A.C. et al. The Warburg effect revisited – lesson from the Sertoli cell. Med Res Rev 2015; 35(1):126–51. DOI: 10.1002/med.21325.
26. Bao Z.Q., Liao T.T., Yang W.R. et al. Heat stress-induced autophagy promotes lactate secretion in cultured immature boar Sertoli cells by inhibiting apoptosis and driving SLC2A3, LDHA, and SLC16A1 expression. Theriogenology 2017;87:339–48. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2016.09.016.
27. Королев Ю.Н., Никулина Л.А., Михайлик Л.В. Влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения на семенники крыс при метаболическом синдроме. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры 2020;97(6-2):59–60.
28. Homolka D., Jansa P., Forejt J. Genetically enhanced asynapsis of autosomal chromatin promotes transcriptional dysregulation and meiotic failure. Chromosoma 2012;121(1):91–104. DOI: 10.1007/s00412-011-0346-5.
29. Turner J., Mahadevaiah S., Fernandez-Capetillo O. et al. Silencing of unsynased meiotic chromosomes in the mouse. Genetics 2005;37(1):41–7. DOI: 10.1038/ng1484.
30. Hu X., Ge X., Liang W. et al. Effects of saturated palmitic acid and omega-3 polyunsaturated fatty acids on Sertoli cell apoptosis. Syst Biol Reprod Med 2018;64(5):368–80. DOI: 10.1080/19396368.2018.1471554.
31. Horibe A., Eid N., Ito Y., Otsuki Y., Kondo Y. Ethanol-induced autophagy in Sertoli cells is specifically marked at androgen-dependent stages of the spermatogenic cycle: potential mechanisms and implications. Int J Mol Sci 2019;20(1): 184. DOI: 10.3390/ijms20010184.
Andrology and Genital Surgery. 2020; 21: 76-88
Study of Sertoli cells and spermatogenic cells in rats with experimentally induced metabolic syndrome and after balneophysiotherapy
https://doi.org/10.17650/2070-9781-2020-21-4-76-88Abstract
Introduction. Metabolic syndrome (MS) can cause impaired spermatogenesis and a decrease in sperm counts. However, the details of the effect of MS on developing spermatogenic cells remain unclear. Difficulties in solving this problem, the inconsistency of published clinical data, indicate the advisability of using experimental models to solve this urgent problem of andrology and reproductology.
The study objective is to describe to investigate the specifics of the course of meiotic prophase I and the activity of the processes of phagocytosis and autophagy in Sertoli cells of rats with experimentally induced MS and in the course of therapeutic and prophylactic procedures during the development of experimental MS.
Materials and methods. The animals were divided into three groups, each of which included four sexually mature male rats: 1st group – males fed a standard diet; 2nd group – males receiving a diet high in fat and fructose for 60 days; 3rd group – males with MS receiving sulphate mineral waters therapy, low-intensity ultrahigh frequency electromagnetic radiation therapy. Testicular cells were examined using light and transmission electron microscopy. For the first time in animals with MS, an immunocytochemical study of the peculiarities of chromosome synapsis in prophase I of meiosis was carried out on the basis of analysis of spread synaptonemal complexes of meiotic chromosomes and immunocytochemical analysis of Sertoli cells and spermatogenic cells in squashed preparations of seminiferous tubules. The parametric Student’s t-test and the nonparametric Mann–Whitney U-test were used for statistical data processing.
Results. As a result of a histological study of the structure of the seminiferous tubules of animals of three groups, a statistically significant decrease in the indices of the spermatogenesis index in 2nd and 3rd groups compared to the control was revealed. Immunomorphologically, in the spread nuclei of primary spermatocytes of rats of the 2nd and 3rd groups, violations of the architectonics of nuclei, the formation of synaptonemal complexes fragments and circular synaptonemal complexes, numerous atypical inclusions were found. Signs of pachytene arrest were found in 40–50 % of spermatocyte nuclei. In the study of squashed cells preparations of the seminiferous tubules of rats of the 2nd and 3rd groups, signs of phagocytosed synaptonemal complexes were found in the cytoplasm of Sertoli cells, which were confirmed using antibodies to the SCP3 protein. Thus, evidence for the phagocytosis of degenerating primary spermatocytes by Sertoli cells has been obtained. In Sertoli cells, spermatocytes and spermatids, many autophagosomes are found, using LC3B protein marker. The presence of autophagosomes in Sertoli cells and spermatogenic cells in animals of these two groups was also confirmed by electron microscopy. In male rats of the 2nd group, significant disturbances in the structure of the pachytene nuclei were revealed. In the cytoplasm of Sertoli cells and spermatids of rats of the 2nd group, lipid droplets, numerous phagolysosomes containing cell detritus were revealed. Structural damage and phagocytosis of mitochondria were found in Sertoli cells and spermatocytes. Аutophagy in Sertoli cells were most distinctive in animals of the 3rd group.
Conclusion. In male rats with experimental MS, significant disturbances in the structure of the nuclei of meiotic cells, a high content of primary spermatocytes with signs of pachytene arrest were revealed. The results obtained are in good agreement with the data of other authors, who revealed a decrease in the number of spermatozoa in the epididymis of rats and mice when modeling MS. It is assumed that the activation of autophagy is an important factor in supporting the viability of Sertoli cells and supporting the viability of germ cells in stressful situations, including MS. Apparently, autophagy is an adaptive mechanism that removes the remnants of apoptotic spermatogenic cells that are selected as a result of MS development.
References
1. Gómez-Elías M.D., Rainero Cáceres T.S., Giaccagli M.M. et al. Association between high-fat diet feeding and male fertility in high reproductive performance mice. Sci Rep 2019;9(1):18546. DOI: 10.1038/s41598-019-54799-3.
2. Carlsen E., Giwercman A., Keiding N., Skakkeback N.E. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. Br Med J 1992;305:609–13. DOI: 10.1136/bmj.305.6854.609.
3. Foresta C., Moro E., Ferlin A. Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis. Endocrine Reviews 2001;22(2):226–39. DOI: 10.1210/edrv.22.2.0425.
4. Epanchintseva E.A., Selyatitskaya V.G., Sviridova M.A., Lutov Yu.V. Mediko-sotsial'nye faktory riska besplodiya u muzhchin. Andrologiya i genital'naya khirurgiya 2016;17(3):47–53. DOI: 10.17650/2070-9781-2016-17-3-47-53. DOI: 10.17650/2070-9781-2016-17-3-47-53.
5. Campbell J.M., Lane M., Owens J.A., Bakos H.W. Paternal obesity negatively affects male fertility and assisted reproduction outcomes: a systematic review and meta-analysis. Reprod Biomed Online 2015;31(5):593–604. DOI: 10.1016/j.rbmo.2015.07.012.
6. Belloc S., Cohen-Bacrie M., Amar E. et al. High body mass index has a deleterious effect on semen parameters except morphology: results from a large cohort study. Fertil Steril 2014;102(5):1268–73. DOI: 10.1016/j.fertnstert.2014.07.1212.
7. Davidson L.M., Millar K., Jones C. et al. Deleterious effects of obesity upon the hormonal and molecular mechanisms control ling spermatogenesis and male fertility. Hum Fertil (Camb) 2015;18(3):184–93. DOI: 10.3109/14647273.2015.1070438.
8. MacDonald A.A., Herbison G.P., Showell M., Farquhar C.M. The impact of body mass index on semen parameters and reproductive hormones in human males: a systematic review with meta-analysis. Hum Reprod 2010;16(3):293–311. DOI: 10.1093/humupd/dmp047.
9. Vigueras-Villaseñor R.M., Rojas-Castañeda J.C., Chávez-Saldaña M. et al. Alterations in the spermatic function generated by obesity in rats. Acta Histochem 2011;113(2):214–20. DOI: 10.1016/j.acthis.2009.10.004.
10. Turner J.M.A., Mahadevaiah S.K., Fernandez-Capetillo O. et al. Silencing of unsynased meiotic chromosomes in the mouse. Genetics 2005;37(1):41–7. DOI: 10.1038/ng1484.
11. Kolomiets O.L., Atsaeva M.M., Dadashev S.Ya. et al. Damage to synaptonemal complex structure and peculiarities of selection of mouse spermatocytes I at response to drug administration. Russian Journal of Genetics 2013;49(11):1098–106. DOI: 10.1134/S1022795413110100.
12. Bogdanov Yu.F., Kolomiets O.L. Sinaptonemnyi kompleks – indikator meioza i izmenchivosti khromosom. M., 2007. 358 s. [Bogdanov Yu.F., Kolomiets O.L. Synaptonemal complex as indicator of chromosome variability. Moscow, 2007. 358 p. (In Russ.)].
13. Korolev Yu.N., Nikulina L.A., Geniatulina M.S. i dr. Profilaktika rannikh poststressornykh narushenii v semennikakh krys pri primenenii pit'evoi sul'fatnoi mineral'noi vody v sochetanii s tsinkom i kremniem. Voprosy kurortologii, fizioterapii i lechebnoi fizicheskoi kul'tury 2011;(5):33–5.
14. Korolev Yu.N., Kurilo L.F., Geniatulina M.S. i dr. Postradiatsionnye narusheniya v semennikakh krys i ikh profilaktika pri primenenii pit'evoi sul'fatnoi mineral'noi vody. Problemy reproduktsii 2003;9(6):16–9.
15. Korolev Yu.N., Geniatulina M.S., Nikulina L.A., Mikhailik L.V. Ul'trastrukturnye proyavleniya regenerativnykh protsessov v kletkakh Sertoli pri deistvii nizkointensivnogo elektromagnitnogo izlucheniya v usloviyakh stressa u krys. Voprosy kurortologii, fizioterapii i lechebnoi fizicheskoi kul'tury 2015;92(3): 40–4.
16. Korolev Yu.N., Nikudina L.A., Mikhailik L.V. Metabolicheskie i ul'trastrukturnye mekhanizmy adaptatsii pri pervichno-profilakticheskom deistvii nizkointensivnogo elektromagnitnogo izlucheniya v usloviyakh normy i radiatsii. Voprosy kurortologii, fizioterapii i lechebnoi fizicheskoi kul'tury 2019;(5):44–50.
17. Ukhov Yu.I., Astrakhantsev A.F. Morfometricheskie metody v otsenke funktsional'nogo sostoyaniya semennikov. Arkhiv anatomii, gistologii i embriologii 1983;84(3):66–72.
18. Navarro J., Vidal F., Guitart M., Egozcue J. A method for the sequential study of synaptonemal complexes by light and electron microscopy. Hum Genet 1981;59(4): 419–21. DOI: 10.1007/BF00295483.
19. Kolomiets O.L., Matveevsky S.N., Bakloushinskaya I.Y. Sexual dimorphism in prophase I of meiosis in the Northern mole vole (Ellobius talpinus Pallas, 1770) with isomorphic (XX) chromosomes in males and females. Comp Cytogenet 2010;4(1):55–66. DOI: 10.3897/compcytogen.v4i1.25.
20. Page J., Suja J.A., Santos J.L., Rufas J.S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res 1998;6(8):639–42. DOI: 10.1023/a:1009209628300.
21. Moens P.B., Earnshaw W.C. Anti-topoiso-merase II recognizes meiotic chromosome cores. Chromosoma 1989;98(5):317–22. DOI: 10.1007/BF00292383.
22. Kerr J.B. Ultrastructure of the seminiferous epithelium and intertubular tissue of the human testis. J Electron Microsc Tech 1991;19(2):215–40. DOI: 10.1002/jemt.1060190208.
23. Kroemer G., Marino G., Levine B. Autophagy and the integrated stress response. Mol Cell 2010;40(2):280–93. DOI: 10.1016/j.molcel.2010.09.023
24. Eid N., Ito Y., Horibe A., Hamaoka H., Kondo Y.A. Method for in vivo induction and ultrastructural detection of mitophagy in Sertoli cells. Methods Mol Biol 2018;1748: 103–12. DOI: 10.1007/978-1-4939-7698-0_9.
25. Oliveira P.F., Martins A.D., Moreira A.C. et al. The Warburg effect revisited – lesson from the Sertoli cell. Med Res Rev 2015; 35(1):126–51. DOI: 10.1002/med.21325.
26. Bao Z.Q., Liao T.T., Yang W.R. et al. Heat stress-induced autophagy promotes lactate secretion in cultured immature boar Sertoli cells by inhibiting apoptosis and driving SLC2A3, LDHA, and SLC16A1 expression. Theriogenology 2017;87:339–48. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2016.09.016.
27. Korolev Yu.N., Nikulina L.A., Mikhailik L.V. Vliyanie nizkointensivnogo elektromagnitnogo izlucheniya na semenniki krys pri metabolicheskom sindrome. Voprosy kurortologii, fizioterapii i lechebnoi fizicheskoi kul'tury 2020;97(6-2):59–60.
28. Homolka D., Jansa P., Forejt J. Genetically enhanced asynapsis of autosomal chromatin promotes transcriptional dysregulation and meiotic failure. Chromosoma 2012;121(1):91–104. DOI: 10.1007/s00412-011-0346-5.
29. Turner J., Mahadevaiah S., Fernandez-Capetillo O. et al. Silencing of unsynased meiotic chromosomes in the mouse. Genetics 2005;37(1):41–7. DOI: 10.1038/ng1484.
30. Hu X., Ge X., Liang W. et al. Effects of saturated palmitic acid and omega-3 polyunsaturated fatty acids on Sertoli cell apoptosis. Syst Biol Reprod Med 2018;64(5):368–80. DOI: 10.1080/19396368.2018.1471554.
31. Horibe A., Eid N., Ito Y., Otsuki Y., Kondo Y. Ethanol-induced autophagy in Sertoli cells is specifically marked at androgen-dependent stages of the spermatogenic cycle: potential mechanisms and implications. Int J Mol Sci 2019;20(1): 184. DOI: 10.3390/ijms20010184.
